任红岳,侯文蓉,杨晓帆,张 辉,张春斌,3

(1.漳州卫生职业学院基础医学部/基础医学部科研平台,福建 漳州 363000;2.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007;3.漳州卫生职业学院医学技术系/转化医学检测应用技术协同创新中心,福建 漳州 363000)

胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤[1]。我国是胆管癌的第2高发区,其发生率在(2.5～5.6)/10万人,处于消化道肿瘤中第5位,且逐年上升[2]。根据解剖位置可以将胆管癌分为肝内、肝外和远端胆管癌。胆管癌是一类异质性极高的肿瘤,不同的解剖位置,其致病机制、肿瘤细胞的起源和基因组学都存在较大的差异。这些异质性给胆管癌的诊断和治疗带来的极大的困难[3]。虽然手术治疗是胆管癌公认的根治手段,但是由于胆管癌解剖位置特殊,起病隐匿,缺乏早期症状,大多数患者确诊时已到晚期,无法接受手术治疗,导致胆管癌治疗很大程度依赖于药物化疗,然而胆管癌对现有化疗药物不敏感,且极易产生抗药性,5 年存活率极低[4]。因此,寻找有效的抗胆管癌药物就变得十分必要且急迫。

厚朴酚是从中草药厚朴中发现的一种主要活性成分,不仅具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗寄生虫的效果,在肿瘤治疗方面也有明显的生物学作用[5]。有文献表明,厚朴酚对多种肿瘤细胞均具有抑制作用,包括乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、鼻咽癌和胆管癌等[6]。本研究表明,厚朴酚与胆管癌关系密切,其可通过调节NF-kB 炎症信号通路影响胆管癌细胞的生物学行为,特别是在胆管癌的生长、迁移和侵袭方面,厚朴酚发挥了明显的抑制作用[7],提示厚朴酚是治疗胆管癌的潜在药物,但仍需进一步探讨两者的具体作用机制。基于以上科学问题及实验基础,本研究拟以网络药理学和分子对接的方法为切入点,探索厚朴酚治疗胆管癌的具体作用靶点。

1 资料与方法

1.1 厚朴酚成分靶点及胆管癌相关靶基因筛选

以“Magnolol”为关键词,在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库中搜索并筛选与厚朴酚成分相对应的靶点,最后将上述 3个数据库的靶点合并,同时删除重复靶点。

1.2 胆管癌相关靶点的获取

以“Cholangiocarcinoma”为关键词进行搜索,在GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/)数据库中检索与胆管癌疾病相关靶点,最后将上述两个数据库的靶点合并,同时删除重复靶点。

1.3 厚朴酚与胆管癌相关靶点的筛选

将上述数据库中得到的厚朴酚与胆管癌相关靶点导入Venny 2.1.0在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny),取交集后得到疾病与药物的共同靶点,即为厚朴酚治疗胆管癌相关靶点。并利用CytoScape 3.9.1软件将相关靶点进行可视化分析。

1.4 蛋白相互作用PPI网络建立

将上述厚朴酚与胆管癌交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org)进而构建蛋白互作(PPI)网络,将结果保存为TSV文件,随后通过CytoScape3.9.1软件进行可视化分析,构建共同靶基因互作网络,筛选厚朴酚与胆管癌的Top10-Hub(核心)靶点。

1.5 GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析

为了研究厚朴酚治疗胆管癌的潜在作用机制,利用DAVID数据库(https://david-d.ncifcrf.gov/)进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的富集分析,导出的数据结果使用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理与分析。

1.6 厚朴酚与靶点分子对接

为了验证厚朴酚与核心靶点的结合能力,从 PubChem[8]数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索厚朴酚的2D分子结构,将数据导入 Chem-Bio 3D Ultro 14.0 软件并转化为 MOL2 文件。从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)检索和下载厚朴酚治疗胆管癌的Top10-Hub(核心)靶点的“PDB”格式 3D 结构文件,再利用 PyMOL软件去水处理及提取原配体结构。随后使用 Auto Dock Tools-1.5.6软件进行分子对接,一般认为分子对接结果中结合能越低,结合亲和力越高,当结合能 ≤-5.0 kcal/mol时,表明厚朴酚和核心靶点之间的结合能力较为良好,最后使用PyMOL软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 厚朴酚靶点筛选

从TCMSP数据库筛选到31个厚朴酚的相关靶点,从Swiss Target Prediction数据库筛选到100个靶点,从STITCH数据库筛选到16个靶点,将上述 3 个数据库得到的靶点进行合并,同时删除重复的相关靶点,最终得到135个厚朴酚的作用靶点。

2.2 胆管癌相关靶基因筛选

在GeneCard数据库筛选到818个靶点,从DisGeNET数据库筛选到877个靶点,将上述两个数据库得到的靶点进行合并,同时删除重复的相关靶点,最后得到1417个胆管癌的作用靶点。

2.3 厚朴酚治疗胆管癌靶点分析

将胆管癌疾病靶点与厚朴酚药物靶点取交集,最终得到厚朴酚治疗胆管癌相关靶点47个,见图1,同时具体的潜在靶点名称,见图2。

图1 胆管癌与厚朴酚靶点取交集Venn图

图2 厚朴酚治疗胆管癌的潜在作用靶点

2.4 PPI网络

通过String数据库构建相关靶点间的相互作用,将厚朴酚治疗胆管癌的47个相关靶点导入STRING数据库,得到PPI蛋白互作网络图,见图3,其中,包含47个节点,预期边线106,实际边线327,平均节点度13.9,PPI 富集P<1.0E-16。利用CytoScape3.9.1软件及插件获取 PPI网络中拓扑参数,并筛选厚朴酚与胆管癌的Top10-Hub(核心)靶点。见图4,节点代表目标蛋白,节点的大小、颜色与靶点的度值相关,节点越大且颜色越接近红色表示度值越大,连线代表蛋白之间的相互作用,节点之间连线的数量越多,表示该节点蛋白越重要。利用CytoScape3.9.1软件中CytoHubba插件筛选出厚朴酚与胆管癌的Top10-Hub(核心)靶点,见图5,包括AKT1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1,Degree=76.0),IL6(白细胞介素-6,Degree=68.0),CASP3(胱天蛋白酶 3,Degree=64.0),CCND1(细胞周期蛋白D1,Degree=60.0),PTGS2(过氧化物合酶2,Degree=56.0),EGFR(表皮生长因子受体,Degree=54.0),ERBB2(酪氨酸激酶受体2,Degree=50.0),MMP9(基质金属蛋白酶9,Degree=50.0),MMP2(基质金属蛋白酶2,Degree=42.0),KDR(激酶插入区受体,Degree=36.0),说明这些核心靶点在厚朴酚治疗胆管癌中发挥重要的作用。

图3 厚朴酚治疗胆管癌的潜在作用靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图(STRING)

图4 厚朴酚治疗胆管癌的潜在作用靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络图(CytoScape3.9.1)

图5 Hub关键基因

2.5 GO富集分析

利用DAVID数据库对47个共有靶点进行GO富集分析,见图6～8,其中靶点的富集程度用圆圈表示,靶点在通路富集的多少用圆圈的大小表示。在厚朴酚治疗胆管癌靶基因生物过程(biological process,BP)富集分析中共得到230条结果,其中前3位的富集生物过程包括负调控凋亡过程(negative regulation of apoptotic process),正向调节细胞增殖(positive regulation of cell proliferation)和蛋白质自身磷酸化(protein autophosphorylation),见图6。在厚朴酚治疗胆管癌靶基因细胞组分(cellular component,CC)富集分析中共得到45条结果,其中前3位的富集细胞组分包括细胞质的核周围区域(perinuclear region of cytoplasm),细胞膜(plasma membrane)和受体复合物(receptor complex),见图7。在厚朴酚治疗胆管癌靶基因分子功能(molecular function,MF)富集分析中共得到49条结果,其中前3位的富集分子功能包括蛋白激酶活性(protein kinase activity),蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)和结合ATP(ATP binding),见图8。

图6 厚朴酚治疗胆管癌靶基因生物过程(BP)富集分析

图7 厚朴酚治疗胆管癌靶基因细胞组分(CC)富集分析

图8 厚朴酚治疗胆管癌靶基因分子功能(MF)富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

在厚朴酚治疗胆管癌靶基因KEGG富集分析结果中共得到120条相关通路,主要涉及PI3K-Akt、FoxO及EGFR等信号通路,其中前3位的富集KEGG通路包括癌症信号通路(Pathways in cancer),内分泌耐药(Endocrine resistance)和膀胱癌(Bladder cancer)。见图9。

图9 厚朴酚治疗胆管癌靶基因KEGG通路富集分析

2.7 分子对接验证

为了验证结论的可信度,利用Autodock软件对degree值前10个核心靶点与厚朴酚进行分子对接,结果显示这10组的结合能均<-5.0 kcal/mol,表明厚朴酚和核心靶点之间的结合能力较为良好,见表1。其中,与厚朴酚结合能力最好的是PTGS2(-8.4 kcal/mol)和MMP9(-8.1 kcal/mol)。将这两组对接结果较好的厚朴酚和蛋白晶体进行可视化,见图10,厚朴酚可以与PTGS2蛋白结构中PRO-528形成氢键,与MMP9蛋白结构中HIS-405、GLU-402、和Zn形成氢键。

3 讨论

胆管癌是起源于胆道系统的恶性肿瘤,由于胆道系统的特殊解剖及胆管癌高侵袭性的特点使手术治疗效果并不理想[9]。药物治疗成为晚期胆管癌患者的主要选择,然而胆管癌对现有化疗药物不敏感,且极易产生抗药性。中医是中华民族的传统瑰宝,将传统的中医药与肿瘤治疗结合起来已然成为医学界的重要关注点。厚朴酚是从中草药厚朴中发现的主要活性成分之一,既往研究表明厚朴酚具有抗肿瘤作用,可以抑制多种肿瘤细胞的生长,包括乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、鼻咽癌和胆管癌等[6]。研究表明,厚朴酚与胆管癌的关系密切,但机制不明[7]。因此,本研究拟以网络药理学和分子对接的方法为切入点,探索厚朴酚治疗胆管癌的具体作用靶点。

研究显示,厚朴酚与胆管癌有47个共同靶点,说明这些靶点是厚朴酚治疗胆管癌的潜在靶点。通过建立 PPI 网络进行拓扑学分析,获得10个关键靶点,分别是AKT1、IL6、CASP3、CCND1、PTGS2、EGFR、ERBB2、MMP9、MMP2、KDR。其中,AKT1信号通路与细胞癌变有关,调节蛋白质合成和细胞存活,并且AKT1通路的失调可能在肝内胆管癌的发展中起重要作用[10]。IL6作为炎症相关的细胞因子参与肿瘤发生和癌症进展过程,有研究表明IL6促进肝内胆管癌细胞的生长和转移。CASP3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点。CCND1编码的分子是调控细胞周期的重要蛋白,可以促进胆管癌细胞的增殖与迁移[11]。PTGS2编码过氧化物合酶2(COX2),大量研究表明COX2相关信号通路在胆管中发挥重要作用,抑制COX2介导的前列腺素信号通路可以为胆管癌的治疗与预防提供新的方向。EGFR信号有助于胆管癌的发生和进展,EGFR抑制剂降低胆管癌细胞环氧COX2的表达[12]。ERBB2是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之一,与胆管癌的进展密切相关,在小鼠中,ERBB2的过度表达导致胆道上皮形成肿瘤。MMP9和MMP2基质金属蛋白酶家族成员,与胆管癌患者的淋巴结转移与预后不良有关[13]。KDR也称血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2),参与胆管癌细胞新生血管的形成,促进其增殖。综上所述,这些关键靶点主要在炎症、细胞周期、血管生成等方面发挥作用,进而影响胆管癌细胞的增殖、迁移、耐药及血管生成等生物学过程,促进胆管癌的发生发展。因此,厚朴酚可以通过调控炎症、细胞周期、血管生成等方面进而治疗胆管癌。另外,本研究对前10个核心靶点与厚朴酚进行分子对接,结合能均<-5.0 kcal/mol,表明厚朴酚和核心靶点之间的结合能力较为良好,进一步验证了上述结论。

GO 功能富集分析结果显示厚朴酚治疗胆管癌的基因功能主要体现在负调控凋亡过程、正向调节细胞增殖和蛋白质自身磷酸化等方面;细胞组分富集分析主要集中在细胞质的核周围区域、细胞膜和受体复合物等方面;分子功能富集分析中主要体现在蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和结合ATP等方面。KEGG通路富集分析结果提示厚朴酚治疗胆管癌相关的信号通路主要体现在癌症、内分泌耐药和膀胱癌等信号通路。

综上所述,基于网络药理学和分子对接分析结果显示,厚朴酚可以通过调控PTGS2和MMP9等关键分子影响胆管癌细胞的增殖和凋亡等生物学过程,从而发挥治疗胆管癌的作用。此项研究为今后开展相关基础实验可以提供一定参考依据,未来随着研究的进一步深入,将厚朴酚作为治疗胆管癌的潜在药物提供更多的可能,为胆管癌患者长期生存获益带来新希望。