吴炜俊，梁喜丽，陈伟澎，黄宇豪，范秀萍,2，秦小明,2

（1.广东海洋大学食品科技学院/ 国家贝类加工技术研发分中心(湛江)/ 广东省水产品加工与安全重点实验室/ 广东省海洋生物制品工程实验室/ 广东省海洋食品工程技术研究中心/ 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，大连工业大学，辽宁 大连 116034）

珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatusi♀×Epinephelus lanceolatus♂）是由鞍带石斑鱼（E.fuscoguttatusi）与棕点石斑鱼（E.lanceolatus）杂交子一代[1]，其养殖区域主要分布在我国东南沿海地区，其鱼肉具有高蛋白、低脂肪、富含多种不饱和脂肪酸的特点，营养价值较高[2]。据2021 年中国渔业年鉴统计，我国石斑鱼养殖总量超过19 万t，且呈逐年增长的趋势。活鲜销售的水产品营养价值更高，更受消费者青睐，利润空间更大[3]。目前水产品进行活鲜销售需通过保活运输从产出地运至销售地，而禁食暂养是保活流通的重要环节之一，可减缓因捕捞、转运等一系列外界环境因素而产生的应激反应[4]，但实际上在禁食暂养过程中，水产品还会遭受如饥饿、氨氮等其他胁迫因子的影响等[5]，使机体受到氧化损伤，降低水产品在保活运输过程中的抗逆能力。因此，需开发新的应激缓解技术，以有效提高保活运输效果。罗勒精油是由罗勒属（Ocimum）植物的叶子经水蒸气蒸馏法等提取得到的具有芳香气味的植物精油，在传统烹饪中常作为天然香料使用[6]；GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定罗勒精油可作为食品添加剂在食品加工中使用。研究表明，罗勒精油对多种鱼类具有休眠镇静作用，在运输时加入一定量的精油可有效缓解鱼类在运输时的应激反应[7]，如在对阿氏冠鲇（Lophiosilurus alexandri）[8]、克氏海葵鱼（Amphiprion clarkii）[9]以及尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）[10]等鱼类的应用研究中均已得到证实。但目前关于罗勒精油对缓解珍珠龙胆石斑鱼应激方面的研究尚未见诸报道，同时，关于缓解鱼类运前暂养的应激反应研究也鲜有报道。因此，本研究以珍珠龙胆石斑鱼为研究对象，探究罗勒精油对石斑鱼禁食暂养胁迫下生理的影响，以期为罗勒精油在水产品保活运输的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

珍珠龙胆石斑鱼（E.fuscoguttatusi♀×E.lanceolatus♂）活鲜品，购自湛江市霞山区水产批发市场，体质量500～700 g。挑选体质健康、无外伤的珍珠龙胆石斑鱼作为实验对象，将鱼放入袋子充氧加水后袋口扎紧打包，在2 h 内运输至广东海洋大学兴海楼保活流通室。

实验鱼暂养用海水，采自广东省湛江市沿海，盐度为23，使用前通过海水净化系统循环过滤1 d以上。鱼用运输三边密封袋（规格40 cm×30 cm×0.4 mm，PA+PE材质），购自雄县卓昌纸塑包装有限公司。罗勒精油（主要成分质量分数为丁香酚67.45%、乙位石竹烯31.44%、甲位石竹烯0.80%、氧化石竹烯0.18%、α-蒎烯0.13%），购自江西源上草香料有限公司。普通级CO2与O2，购自湛江市世纪双龙工业气体有限公司。乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（GOT）、乳酸（LD）、还原性谷胱甘肽（GSH）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、糖原检测试剂盒，购自南京建成生物有限公司；皮质醇（COR）、热休克蛋白70（Hsp70）酶联免疫试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；过氧化氢酶（CAT）试剂盒，购自苏州格锐思生物科技有限公司；葡萄糖（Glu）测定试剂盒，购自上海荣盛生物药业有限公司；无水乙醇、分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222），购自阿拉丁生物试剂公司。

1.2 仪器与设备

海水净化系统，广州铭创生物科技有限公司；Varioskan 全自动酶标仪，美国ThermoFisher 公司；BSA224S-CW 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；低温生化培养箱，北京亚星仪科科技有限公司；便携式pH计，上海雷磁仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1 罗勒精油暂养浓度对无水保活石斑鱼的存活时间与存活率的影响 实验均于2021年10月进行，气温25 ℃。将购得的30 尾珍珠龙胆石斑鱼称重，按鱼质量（kg）∶海水体积（L）为1∶10 的比例量取已过滤的新鲜海水于暂养池中。罗勒精油按暂养海水体积称量，并用10 倍体积的无水乙醇溶解混匀，然后分别加入到的新鲜海水中，充分混匀，分别配制罗勒精油质量浓度为0、5、10、20、40 mg/L 的暂养海水，同时设置乙醇对照组（乙醇添加量按最大梯度浓度溶解量添加）。将体长与体质量相近的珍珠龙胆石斑鱼随机分成4 组，每组6 尾，分别放入不同罗勒精油暂养浓度的海水中，在水温为（21±1）℃的海水中禁食暂养24 h。暂养结束后，参考范秀萍等[11]的无水保活实验方法，通过梯度降温将暂养水体降温至18 ℃后，使用pH 值5.8 的CO2麻醉液对石斑鱼进行休眠处理，待鱼进入休眠状态后，放入鱼用运输袋中封口，充入O2，然后放入设定温度为15 ℃的低温恒温箱中进行静态模拟无水保活实验，记录不同时间石斑鱼的存活时间，计算存活率。

1.3.2 罗勒精油暂养时间对无水保活珍珠龙胆石斑鱼的存活时间与存活率的影响 按1.3.1 节的方法配制质量浓度为10 mg/L 罗勒精油，将24 尾珍珠龙胆石斑鱼随机按暂养时间分为0、12、24、36 h 四组，每组6 尾，暂养水温为（21 ± 1）℃。按照1.3.1 节实验方法步骤对石斑鱼进行静态模拟无水保活实验，记录不同实验组石斑鱼的存活时间与存活率。

1.3.3 罗勒精油暂养时间对珍珠龙胆石斑鱼生理生化指标的影响 将24 尾珍珠龙胆石斑鱼按照1.3.2节的方法暂养，同时设置未添加精油暂养的处理方式为对照组，然后分别在暂养0、12、24、36 h 时各取3 尾鱼，参照黄湘媚等[12]方法将鱼快速取出并放入含有200 mg/L MS-222 的海水中麻醉至鱼体无明显反应，时间不超过2 min。使用10 mL注射器在鱼的尾部静脉取全血，然后快速注入2 mL 离心管中，不添加抗凝剂，在4 ℃冰箱中静置2 h后放入低温离心机，在4 ℃、3 000 r/min 条件下离心20 min，取上层血清放入超低温冰箱待测。在冰上取鱼肉的肝脏、背肌以及脑，背肌与肝脏使用已预冷的生理盐水清洗干净血迹并使用滤纸吸干水分，绞碎后放入冻存管中，鱼脑则吸干水分后直接放入冻存管中。用液氮迅速将组织急冻并放入超低温冰箱待测，按照试剂盒说明书的步骤与要求对各个指标进行测定。

1.4 数据处理

实验结果均平行测定3 次，采用SPSS 26 软件对实验数据进行统计和显著性分析，结果以平均值± 标准偏差表示，显著性差异使用单因素分析（ANOVA）结合Tukey 检验进行多重比较，显著性水平α为0.05。

2 结果与讨论

2.1 罗勒精油暂养质量浓度对珍珠龙胆石斑鱼无水保活的存活时间与存活率的影响

表1 可见，在罗勒精油质量浓度为10 mg/L 时，其无水保活的存活时间可延长至（19.7±0.5）h，存活率为66.7%，比对照组延长5.7 h，对照组存活率为0；在17 h 时其存活率可保持100%；而在5 mg/L暂养质量浓度下与对照组及乙醇对照组无显著差异，其存活率为0（P ＞0.05），在质量浓度为20 mg/L和40 mg/L 下的珍珠龙胆石斑鱼，暂养1 h 后全部死亡。

表1 罗勒精油质量浓度对珍珠龙胆石斑鱼无水保活的影响Table 1 Effects of mass concentration of basil essential oil on pearl gentian grouper in waterless transport

罗勒精油主要成分为丁香酚，许多研究已表明丁香酚对鱼有镇静休眠作用。在Benovit 等[13]针对不同罗勒精油浓度对鲇（Silurus asotus）镇静休眠效果的实验中，表明鱼在不同浓度的罗勒精油麻醉液中有着不同行为特性[14]。本研究中珍珠龙胆石斑鱼在罗勒精油质量浓度为20 mg/L 与40 mg/L 的海水中暂养1 h 后出现死亡，说明这两个浓度已达到罗勒精油对珍珠龙胆石斑鱼的麻醉阈值，长时间的麻醉作用使鱼呼吸中枢麻痹导致死亡[15]，而在5 mg/L和10 mg/L 的质量浓度中暂养可正常存活24 h。10 mg/L 质量浓度的实验结果表明珍珠龙胆石斑鱼在该质量浓度下的罗勒精油中暂养能有效延长无水保活时间。在暂养过程中加入低浓度精油，可一定程度上忽略鱼的运输保活方式的考虑，极大程度延展精油在保活运输使用范围，Wang 等[16]在海鲈（Lateolabrax maculatus）有水保活运输过程中加入低于麻醉浓度的香蜂草精油后，有效延长海鲈的存活时间，Boaventura 等[8]对阿氏冠鲇（Lophiosilurus alexandri）在运输过程中使用罗勒精油的研究也得出相似的结论，但以上研究结果仅适用于有水保活运输，相比于本研究存在着较大的应用局限性。

2.2 罗勒精油暂养时间对珍珠龙胆石斑鱼无水保活的的存活时间与存活率的影响

由表2 可见，珍珠龙胆石斑鱼未经暂养（0 h）直接进行无水保活，其存活时间为（12.8±0.8）h，经罗勒精油暂养12 h 与24 h 后石斑鱼无水保活的存活时间均超过17 h，存活率分别为66.7%、83.3%；经罗勒精油暂养36 h 后，石斑鱼无水保活存活时间缩短至（15.1±0.8）h，存活率为66.7%。

表2 暂养时间对珍珠龙胆石斑鱼无水保活的的影响Table 2 Effects of culture time on pearl gentian grouper in waterless transport

暂养时间是禁食暂养环节中的关键影响因素，过短的暂养时间无法使鱼类体内的应激水平与代谢废物含量下降，缩短在保活运输过程的存活时间，过长则会导致暂养水质恶化以及因禁食导致的能量物质大量消耗，减弱鱼类在后续保活运输中的抗逆能力[5]。朱乾峰等[13]通过保活实验得到珍珠龙胆石斑鱼最佳暂养时间为24 h，但在本实验中暂养12 h后珍珠龙胆石斑鱼的无水保活存活时间与暂养24 h 后的无显著差异，说明罗勒精油能有效缩短珍珠龙胆石斑鱼所需的暂养时长；然而，在无水保活15 h后的两个不同暂养时长的珍珠龙胆石斑鱼无水保活成活率出现差异，说明添加罗勒精油暂养后，暂养时间的长短对珍珠龙胆石斑鱼无水保活仍旧有影响，在暂养36 h 后珍珠龙胆石斑鱼存活时间显著下降，可能是长时间的饥饿胁迫与水质恶化导致。

2.3 罗勒精油对暂养胁迫下珍珠龙胆石斑鱼的血清生化指标的影响

不同暂养时间中珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标的变化（表3）显示，在暂养过程中，石斑鱼血清中的COR 质量浓度均显著低于对照组组（P ＜0.05），对照组分别是实验组的2.12、1.69和1.41倍；实验组BUN 浓度在相同的时间段显著低于对照组（P ＜0.05）；两组石斑鱼血清中GOT 酶活力均呈先下降后上升的趋势，在暂养24 h时实验组GOT酶活力显著低于对照组（P ＜0.05）；两组石斑鱼血清中LDH酶活力呈先下降后上升的趋势，在12 h 时，实验组与对照组无显著差异，24 h 实验组显著低于对照组（P ＜0.05），在36 h 时两组LDH 酶活力无显著差异（P ＞0.05）。

表3 不同暂养时间中珍珠龙胆石斑鱼的血清生化指标的变化Table 3 Changes of basil essential oil in serum biochemical indexes of pearl gentian grouper under different temporary culture time

硬骨鱼在受到外部胁迫因素的刺激后，会将皮质醇（COR）释放至全身[17]，因此常将COR 质量浓度作为评价硬骨鱼应激水平的标志物。本研究中对照组的珍珠龙胆石斑鱼血清COR 质量浓度在暂养过程中始终高于实验组，说明在暂养过程中石斑鱼受到胁迫因素，使COR 持续分泌，加入罗勒精油暂养后使石斑鱼因胁迫的影响得到缓解，具有镇静效果。

尿素氮（BUN）是机体代谢蛋白后的最终产物，在胁迫作用下，珍珠龙胆石斑鱼血清中BUN浓度会升高[12]。在本研究中，加入罗勒精油暂养后，实验组石斑鱼血清中BUN浓度相比对照组降低，说明加入罗勒精油暂养减缓应激水平升高导致BUN 浓度增加，体内代谢废物累积量下降，这可能是加入罗勒精油暂养后能使无水保活时间延长的原因之一[18]。

谷草转氨酶（GOT）的释放量反映肝脏受损程度[19]。与暂养0 h时相比，在暂养12 h时两组石斑鱼GOT 酶显著下降，显示加入罗勒精油暂养能有效缓解因短途运输造成的肝脏损伤。随着暂养时间的延长，受到氨氮与饥饿胁迫的影响，GOT 酶活力逐渐上升[5]，加入罗勒精油暂养能明显减缓其上升的趋势，说明罗勒精油可有效减缓长时间暂养胁迫对石斑鱼肝脏的损伤。

乳酸脱氢酶（LDH）作为糖酵解酶，反映糖酵解的作用强度[20]，在受到胁迫后，血清中LDH 酶活力提升[21]。本实验中暂养24 h后实验组珍珠龙胆石斑鱼血清中LDH酶活力上升趋势显著高于对照组，说明加入罗勒精油能在一定程度上缓解因暂养过程中的胁迫因素导致的糖酵解作用增强，减少乳酸的堆积；后期升高可能是饥饿胁迫增强，精油缓解作用减弱所致。

2.4 罗勒精油对暂养胁迫下珍珠龙胆石斑鱼组织中应激响应的影响

由珍珠龙胆石斑鱼肝脏应激相关响应指标变化（表4）可见，与暂养0 h 相比，两组石斑鱼肝脏中MDA 含量在暂养12 h 时均显著下降（P ＜0.05），实验组在不同时间段MDA 变化差异不显著，在24 h、36 h时与对照组相比显著低于对照组（P ＜0.05），对照组MDA 含量变化较大，不同时间段均有显著差异（P ＜0.05）。在不同时间段实验组Hsp70含量均显著高于对照组（P ＜0.05）。肝脏CAT 酶活力在暂养过程中总体呈先下降后上升的趋势，实验组在24 h、36 h 时无显著差异（P ＞0.05），但显著低于对照组（P ＜0.05）。

表4 不同暂养时间中珍珠龙胆石斑鱼肝脏应激响应相关指标的变化Table 4 Changes of related indexes of liver stress response in pearl gentian grouper under different temporary culture time

表5反映珍珠龙胆石斑鱼脑部氧化应激指标在暂养过程的变化。与暂养0 h 相比，实验组石斑鱼脑部的MDA 含量在不同时间段均显著降低（P ＜0.05），且在相同暂养时间下均显著低于对照组（P ＜0.05）。Hsp70 含量在不同时间段显著高于对照组（P ＜0.05）；GSH 含量在12 h 时与对照组有显著差异外，其余时间段与对照组无显著变化（P ＞0.05）。

表5 不同暂养时间中珍珠龙胆石斑鱼脑部应激响应相关指标的变化Table 5 Changes of related indexes of brain stress response in pearl gentian grouper under different temporary culture time

鱼在受到应激胁迫时，产生的氧化自由基会导致组织细胞脂质过氧化物生成如丙二醛（MDA）等，导致器官损伤，MDA 的产生也会使肌肉品质下降[22]。同时，肝脏与脑部为对抗应激会激活抗氧化系统来消除体内的氧化自由基[23]。本研究中，石斑鱼肝脏和脑部的MDA 含量对照组始终高于实验组，说明罗勒精油暂养能有效降低组织细胞中的脂质过氧化反应；两组肝脏CAT 酶活力在前12 h 时的下降趋势是暂养后石斑鱼体内稳态恢复的表现，但随着暂养时间的延长，胁迫因素的影响会激活机体抗氧化系统导致肝脏CAT 酶活性上升，但实验组上升幅度更小，说明罗勒精油能减少的石斑鱼肝脏过氧化氢的累积，减少肝脏的损伤程度。在暂养12 h内实验组脑部GSH 水平显著下降，表明罗勒精油能在一定时间内使暂养导致脑部损伤减少。

热休克蛋白70（Hsp70）是一种存在于组织中的修复性蛋白，在鱼受到胁迫时机体会释放Hsp70 来修复因氧化损伤的组织细胞，增加机体对胁迫的耐受能力[24]，也是细胞通过基因表达来应对胁迫的表现[25]。Basu等[26]认为皮质醇的大量释放会抑制一些热休克蛋白基因的表达，从而使得热休克蛋白释放量减少。因此，在暂养过程中，对照组的石斑鱼组织中Hsp70 释放量较低，可能是由于对照组石斑鱼皮质醇释放量过高导致，降低了对照组石斑鱼组织损伤修复能力，使机体对胁迫的耐受能力下降，从而使得保活时间缩短，加入精油暂养后的这一情况得到改善。

2.5 罗勒精油暂养水体对珍珠龙胆石斑鱼能量物质及其代谢产物的影响

在暂养过程中珍珠龙胆石斑鱼能量物质及其代谢产物会发生变化，结果见表6。石斑鱼血糖随着暂养时间的增加，对照组与实验组血糖含量均显著下降（P ＜0.05），但对照组比实验组下降更快。肝糖原含量随暂养时间的增加而显著上升，在不同时间段，实验组肝糖原含量均显著低于对照组（P ＜0.05）。两组肌糖原在暂养过程无太大变化。实验组肝乳酸含量呈先下降后上升的趋势，在24 h 时达到最低，且均显著低于相同暂养时间里对照组肝乳酸含量（P ＜0.05）；而两组肌乳酸含量在暂养12 h内无显著变化（P ＞0.05），在24 h时实验组肌乳酸含量显著低于对照组（P ＜0.05），在暂养36 h时两组肌乳酸含量均升高且两组间无显著差异（P ＞0.05）。

表6 不同暂养时间中珍珠龙胆石斑鱼的能量物质及代谢产物的变化Table 6 Changes of energy substances and metabolites of pearl gentian grouper under different temporary culture time

血糖（Glu）、糖原（GLY）、乳酸（LD）之间含量的变化关系可以反映机体对能量代谢物质的使用情况[27]。鱼受到胁迫后，在HPI 轴的应激的响应机制会促进糖原释放葡萄糖，机体加快对血液中葡萄糖的消耗来对抗胁迫[28]。在本研究中，暂养胁迫的持续使对照组石斑鱼血糖含量迅速下降，但加入精油暂养后延缓血糖下降速率，这与鉏晓艳等[29]探究使用亚硒酸钠缓解暂养过程中斑点叉尾鮰的应激作用的实验结果一致。在暂养过程中，实验组珍珠龙胆石斑鱼肝脏乳酸和糖原含量显著低于对照组，说明在暂养过程中罗勒精油具有应激缓解作用，使得血糖的消耗与转化得以减少，但具体的能量转化过程有待进一步研究。乳酸过度积累会引起疲劳[30]，不利于暂养后的保活运输，这可能是实验组无水保活时间更长的原因之一。

3 结论

珍珠龙胆石斑鱼在罗勒精油浓度为10 mg/L 的海水中暂养，能将无水保活的存活时间延长至（19.7±0.5）h，对不同暂养时间的石斑鱼的血清及组织的生理生化指标进行分析，加入罗勒精油暂养后石斑鱼血清中的皮质醇质量浓度显著低于空白对照组（P ＜0.05），在暂养过程血清中BUN 浓度显著低于对照组（P ＜0.05），LDH 与GOT 酶活力上升趋势减缓。与空白对照组相比，加入罗勒精油暂养后石斑鱼肝脏、脑部等器官的Hsp70 释放量显著升高（P ＜0.05），MDA 含量显著下降（P ＜0.05），组织的修复能力得到增强，脂质过氧化程度得以缓解，CAT酶与GSH 的响应程度均有所降低；石斑鱼血糖的消耗速率减缓，肝脏的乳酸积累量显著下降（P ＜0.05）。在暂养过程中珍珠龙胆石斑鱼仍会受到一定程度的胁迫因素影响，导致体内氧化应激水平上升，石斑鱼抗逆能力下降，在加入罗勒精油暂养后可使石斑鱼组织中Hsp70 含量显著升高，减少组织中脂质过氧化物MDA 的产生和乳酸的积累，随着暂养时间的延长，石斑鱼体内的应激响应和能量响应上升强度减缓，鱼体组织所受的损伤和代谢物累积减少，可减少暂养所需的时间，延长珍珠龙胆石斑鱼无水保活的存活时间。