陈金凤,鹿孟云,刘华彬,祝嫦巍*

(1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100)

紫杉醇是一种从红豆杉属植物中提取的具有特殊结构的二萜类生物碱[1],可以与微管结合并使其稳定不解聚,从而导致细胞的生理活动异常,诱导细胞凋亡,是目前治疗卵巢癌、乳腺癌的首选药物,并且对白血病、肺癌、直肠癌以及其他一些实体瘤等均有很好的疗效,且其不良反应相对较小[2],临床应用范围广、前景大。

紫杉醇最早从红豆杉的树皮中直接提取,红豆杉中紫杉醇含量仅为0.015%,生产1 kg紫杉醇需要2 000～2 500棵成年的红豆杉树木[3],产量低,价格高。红豆杉树生长缓慢,野生红豆杉已被列为濒危的珍稀保护植物[4]。因此探索其他生产紫杉醇的方法,以解决紫杉醇原料药的来源问题成为近年的研究热点。Das等[5]从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中分离到一株能独立合成紫杉醇的内生真菌(Taxomycesandreanae),为解决紫杉醇原料药的来源提供了新的思路和途径。随后,国内外学者纷纷开展紫杉醇内生真菌的分离工作,不仅从红豆杉及其近缘植物中发现了紫杉醇内生真菌,还从非红豆杉属植物中分离到了可产紫杉醇的内生真菌[6-8]。产紫杉醇真菌在自然界中广泛存在,且具有较高的多样性。

虽然真菌产紫杉醇提供了一种可能的生产途径,但目前报道的菌株产量均较低,无法满足工业化生产的需要。因此除了新菌株的分离鉴定,人们也通过大量的工作对已有菌株的发酵条件进行优化,以期提高产量进而达到工业化生产的要求。Xu等[9]通过优化氮源、微量元素等培养基组分,将Fusariummaire的紫杉醇产量提高至225.2 μg/L,提高约1.31倍。苗莉云等[10]通过优化各种培养条件,包括培养基的初始pH、培养温度、摇床转速、培养时间等,将枝状枝孢霉MD2的紫杉醇产量提高至569.5 μg/L,约为初始值的3.4倍。目前是在培养基中添加前体物或诱导子来提高真菌紫杉醇的产量。乔广军等[11]向培养基中加入20 mg/L苯丙氨酸、10 mg/L乙酸铵、5 mg/L酪氨酸、20 mg/L甘氨酸时,紫杉醇产量显著提高,达到547 μg/L,比初始产量高337%。苟莉等[12]报道,在液体培养基中加入20 mg/L苯丙氨酸、30 mg/L苯甲酸钠、8 g/L乙酸钠、15 mg/L甘氨酸、0.05 mg/L CuSO4、6 mmol/L H2O2、15 mg/L 3,5-二硝基水杨酸时能有效提高紫杉醇产量,比优化前增产46.64%。目前虽然有较多研究,但由于菌株特性的差异以及实验者所采用的策略不同,不同前体物或诱导子的影响差异较大。

本试验对一株产紫杉醇真菌JM-25进行研究,通过在液体培养基中添加氨基酸,探讨氨基酸的种类、添加时间以及添加量对紫杉醇合成的影响,为后期的发酵生产和工业化制备紫杉醇奠定基础,也为紫杉醇合成途径的理论研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 真菌JM-25,安徽科技学院生物综合实验中心实验室分离保存。

1.1.2 试剂 紫杉醇标准品(北京索莱宝科技有限公司);缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,甲硫氨酸,丙氨酸,脯氨酸,丝氨酸,酪氨酸,谷氨酸,苏氨酸,甘氨酸,半胱氨酸,天冬酰胺,赖氨酸,谷氨酰胺,天门冬氨酸,精氨酸,组氨酸(AR,上海麦克林生化科技有限公司);葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、二氯甲烷(AR,西陇科学股份有限公司);甲醇(色谱纯,西陇科学股份有限公司)。

1.1.3 仪器 LQ-A10002电子天平(瑞安市安特称重设备有限公司);Agilent1260高效液相色谱仪(美国Agilent科技公司);HPX-9082MBE型电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);HZ500L型双门双层全自动恒温摇床(武汉瑞华仪器设备有限责任公司);XD52CS型旋转蒸发器(上海贤德实验仪器有限公司);KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.4 培养基 PDA固体培养基：200 g去皮马铃薯、20.0 g葡萄糖、1.5 g硫酸镁、3.0 g磷酸二氢钾、15.0～20.0 g琼脂、1 000 mL水,pH自然,121 ℃,高压蒸汽灭菌20 min。PDB液体培养基：不添加琼脂,其他成分与PDA相同。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及发酵培养 菌种首先在PDA固体培养基上活化。在无菌条件下,将固体培养基上的菌种切成小块,接入装有100 mL PDB液体培养基的250 mL的三角瓶中,每个摇瓶中接入约四分之一平板的菌种量,26 ℃、160 r/min振荡培养7 d,作为种子液。将培养好的种子培养液均质,以5%的量接种接于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中,26 ℃、160 r/min振荡培养。

1.2.2 生物量的测定 发酵液离心,收集菌丝,置于50 ℃烘干至恒重,称量菌体质量。

1.2.3 紫杉醇的提取 将每瓶样品加入50 mL二氯甲烷,置于摇床上振荡过夜,充分萃取。收集下层有机相,于40 ℃旋转蒸干,用2 mL的无水甲醇溶解干燥物,0.22 μm的微孔过滤器过滤后保存备用。

1.2.4 紫杉醇产量的测定 采用高效液相色谱(HPLC)法检测。色谱条件：色谱柱为Agilent 5 HC-C18(2)色谱柱,流动相为甲醇∶水(V/V)=75∶25,柱温为25 ℃,波长为227 nm,流速为0.500 mL/min,进样量为20 μL,用紫杉醇标准品做对照。

1.2.5 数据分析 所有样品一式3份,试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 培养时间对菌株生物量及其紫杉醇产量的影响

在液体培养条件下,菌株JM-25的生物量积累及紫杉醇产量结果分别如图1～2。21 d的培养过程中,每3天取样1次,测定菌株的生物量及发酵液中的紫杉醇产量。如图1所示,随着培养时间的延长,生物量逐渐积累,在培养至第15天获得最大生物量11.25 g/L。

图1 培养时间对菌株JM-25生物量的影响Fig.1 Effects of culture time on biomass of strain JM-25

紫杉醇产量在培养第9天时达到最大值(145.93 μg/L),之后略有波动,但随培养时间延长,紫杉醇产量出现下降趋势(图2)。综合考虑菌丝生长、紫杉醇产量、时间等因素,以下试验均为7 d培养的结果。

图2 培养时间对菌株JM-25合成紫杉醇的影响Fig.2 Effects of culture time on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.2 不同种类的氨基酸对紫杉醇产量的影响

常见的20种氨基酸可以分为非极性氨基酸和极性氨基酸,极性氨基酸又可以分为带电荷和不带电荷的氨基酸。在培养基中添加终浓度为1 mmol/L的氨基酸,对菌株JM-25发酵产紫杉醇的影响如图3所示,添加8种非极性氨基酸均对JM-25的紫杉醇产量有一定的提高作用,其中苯丙氨酸对紫杉醇的产量影响最大,产量达到了314.1 μg/L,约为对照的2.04倍。添加亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸也分别获得269.6、240.8、217.6 μg/L紫杉醇产量。极性不带电氨基酸对JM-25紫杉醇产量的影响如图4所示,其中添加酪氨酸对JM-25的紫杉醇产量影响最大,平均产量为315.1 μg/L,比对照提高了2.05倍。极性带电氨基酸对JM-25的紫杉醇产量没有明显的促进作用,相反,添加赖氨酸和精氨酸还表现出一定的抑制作用(图5)。

图3 非极性氨基酸对菌株JM-25紫杉醇产量的影响Fig.3 Effects of nonpolar amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

图4 极性不带电氨基酸对菌株JM-25紫杉醇产量的影响Fig.4 Effects of polar non-charged amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

图5 极性带电氨基酸对菌株JM-25紫杉醇产量的影响Fig.5 Effects of polar charged amino acids on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.3 氨基酸浓度对紫杉醇产量的影响

根据不同种类氨基酸对产量的影响,筛选出了对JM-25的紫杉醇产量影响较大的酪氨酸和苯丙氨酸,进一步探讨添加不同浓度的酪氨酸和苯丙氨酸对JM-25的紫杉醇产量的影响。如图6～7所示,随着培养基中氨基酸浓度的增加,紫杉醇的产量也逐渐增加,酪氨酸和苯丙氨酸均在终浓度1.5 mmol/L时产量较高,分别是355.4 μg/L和348.7 μg/L,较对照提高了2.40倍和2.35倍。但添加终浓度1.5 mmol/L与2 mmol/L之间基本没有差异,添加酪氨酸和苯丙氨酸的变化趋势也基本无差异。

图6 不同浓度酪氨酸对JM-25紫杉醇产量的影响Fig.6 Effects of tyrosine concentration on the paclitaxel yield of strain JM-25

图7 不同浓度苯丙氨酸对JM-25紫杉醇产量的影响Fig.7 Effects of phenylalanine concentration on the paclitaxel yield of strain JM-25

2.4 不同添加时间对紫杉醇产量的影响

在不同的培养时间添加终浓度1.5 mmol/L的酪氨酸和苯丙氨酸对产量的影响结果如图8～9所示。随着添加时间的后延,酪氨酸和苯丙氨酸对JM-25紫杉醇产量的促进作用呈现上升趋势。在培养0、2、4、6 d添加酪氨酸,分别获得251.8、276.0、480.2、607.3 μg/L紫杉醇,为对照组的1.81、1.99、3.46、4.37倍;添加苯丙氨酸分别获得240.8、406.8、431.3、453.5 μg/L的产量,为对照组的1.73、2.93、3.11、3.26倍。

图8 酪氨酸添加时间对JM-25紫杉醇产量的影响Fig.8 Effects of tyrosine addition time on the paclitaxel yield of strain JM-25

图9 苯丙氨酸添加时间对JM-25紫杉醇产量的影响Fig.9 Effects of phenylalanine addition time on the paclitaxel yield of strain JM-25

3 结论与讨论

本研究探讨在液体培养条件下,添加氨基酸对菌株JM-25产紫杉醇的影响。结果显示,在培养基中添加酪氨酸和苯丙氨酸对紫杉醇合成的促进作用最大,在培养第6天添加终浓度为1.5 mmol/L的氨基酸,第7天收获,获得最大产量607.3 μg/L(添加酪氨酸)和453.5 μg/L(添加苯丙氨酸)。

在液体培养条件下,大多数氨基酸对紫杉醇的合成具有促进作用,只有少数如精氨酸、赖氨酸对紫杉醇的合成有抑制作用。20种氨基酸根据侧链上R基团的不同,分为极性和非极性氨基酸,从本试验结果看,对紫杉醇合成的影响与R基团的性质没有关系,因为酪氨酸属于极性氨基酸,而苯丙氨酸属于非极性氨基酸。从目前已知的紫杉醇合成途径分析[13-15],苯丙氨酸从1个侧链反应参与紫杉醇的合成。结构式上看,酪氨酸与苯丙氨酸都具有1个苯环结构,也是区别于其他氨基酸的重要特征,因此推测可能是二者促进紫杉醇合成的原因,即为紫杉醇合成提供前体物。

在前期的筛选中,亮氨酸和异亮氨酸也具有较好的促进作用,也是值得关注的影响因子,但目前没有更多的数据证明其作用原理,各种试验仍在进一步探讨中。