王大全,王俊颖,翟立公,时志军,曹双双,杨剑婷*

(1.安徽科技学院 食品工程学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽省凤阳县健民蓝莓农业发展有限公司,安徽 凤阳 233100)

蓝莓又称越橘,为多年生落叶常绿灌木[1],蓝莓果实为红色、紫色或蓝黑色的小浆果,形状接近圆形[2]。其果实中含有较多的人体营养成分,具有良好的养生功效,如保护视力,强健心脏,以及增强机体免疫力,延缓神经衰老等功能[3]。目前,蓝莓以其丰富的营养价值和良好的生物功效,引起了人们的广泛关注,从而促进了蓝莓制品产业的发展。利用蓝莓为原料,已经生产出了不同种类的产品,如蓝莓粉、蓝莓果冻、蓝莓果酱以及蓝莓味饮料等[4]。多酚是分子中具有多种羟基酚的总称,为次生代谢产物,是由植物中的酚类物质所产生的,主要存在于皮、根、叶和果实中。蓝莓中有多种富含多酚的物质,如花色苷类、单宁类、黄酮类等,多酚还具有抗氧化以及抗炎作用,可有效预防心血管病、癌症等[5]。

由于对蓝莓多酚需求的逐渐增加,蓝莓多酚提取工艺技术的研究不断发展。目前,提取多酚的方法有多种,如溶剂提取法、超声波辅助法、微波提取法等[6-8],而采用酶法提取果渣多酚的报道并不多。在果渣中多酚多以聚合物的形式存在,通常以糖苷键、氢键或疏水键与糖类、蛋白质、纤维素以及淀粉等结合,形成稳定的复合物[9]。纤维素酶可以破坏和降解细胞壁中的纤维素和果胶,使蓝莓果渣中的植物细胞的原生质体和液泡由于细胞壁损失而被破坏,释放出多酚和其它活性物质,从而达到提取蓝莓果渣中多酚的目的。酶法提取不仅具有试验操作简单、提取条件温和的特点,还具有安全环保、营养素损失小的特点,从而可以有效降低提取温度、缩短提取时间,提高产物得率[10-12]。本研究利用纤维素酶较高的选择性和较强的特异性提取蓝莓果渣中的多酚,显著提高多酚的提取率,为蓝莓果渣的综合利用和加工开辟新的途径[13-15]。因此,本试验采用纤维素酶法提取蓝莓果渣中的多酚,对纤维素酶用量、提取初始pH、料液比、提取时间、温度等因素进行探究,并且采用响应面分析法对各因素进行优化研究,以此确定最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 供试材料

干制蓝莓果渣(实验室自制);福林酚(上海蓝季生物技术有限公司);没食子酸(国药集团化学试剂有限公司);纤维素酶(国药集团化学试剂有限公司);无水碳酸钠,盐酸(AR,国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 试验仪器

UV-5100型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);DL-5-B型低速离心机(上海安亭科学仪器厂);FE22型pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.3 测定项目及分析方法

1.3.1 多酚标准曲线绘制 在0～1.2 mL范围(0.2 mL的体积梯度)内准确吸收没食子酸标准溶液,加入1 mL福林酚试剂,混匀,室温静置5 min,加入3 mL 10% Na2CO3溶液后定容摇匀,室温暗处放置2 h后,在波长760 nm下,以没加标准液的溶液作为空白对照,测定吸光度[16]。

1.3.2 多酚含量测定 将蓝莓果渣离心后得到的上清液,测其体积并稀释,取0.2 mL样品溶液置于体积为10 mL的容量瓶中,每组做3个平行试验,测定样品中的吸光度,建立标准曲线,计算样品溶液中的多酚含量和多酚得率[17]。

1.3.3 提取蓝莓果渣多酚的工艺流程 将蓝莓渣60 ℃烘干,粉碎过筛保存。称取一定量的蓝莓渣粉,蒸馏水溶解加入纤维素酶恒温水浴,离心取上清液。

1.3.4 多酚提取工艺的单因素试验 称取蓝莓果渣10 g,置于250 mL三角瓶中,考察提取时间(2、4、6、8、10 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)、酶用量(0、2、5、10、15 mg/g)、初始pH(4.0、4.4、4.8、5.2、5.6)和温度(40、45、50、55、60 ℃)等5种因素的影响,分别进行单因素试验,测定多酚的得率。

1.3.5 多酚提取工艺的响应面试验 根据单因素试验结果,利用响应面分析软件设计以料液比、pH、酶用量作为考察因素,进行蓝莓果渣多酚提取的优化组合[18]。各因素水平的设计见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Response surface test factors

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线的绘制

以没食子酸的质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线如图1所示,标准曲线方程为y=0.133 7x+0.045 1,R2=0.997 8。

图1 多酚含量的标准曲线Fig.1 Standard curve of polyphenols content

2.2 提取时间对多酚得率的影响

由图2所示,在2～6 h内,随着提取时间的延长,多酚得率逐渐上升;当提取时间达到6 h时,多酚得率得到最大值,为(8.07±0.24) mg/g;当提取时间超过6 h,多酚得率开始缓慢下降,因为提取时间过长,温度会对多酚的分子结构产生破坏,促使多酚发生氧化或者降解等不可逆的化学反应[19],导致其含量降低。由图2可知,当提取时间超过6 h,蓝莓多酚含量没有明显的降低,可知提取时间对多酚提取的影响较小,因此提取时间不作为考察因素,在响应面试验中固定提取时间为6 h。

图2 提取时间对多酚得率的影响Fig.2 Effects of time on the yield of polyphenols

2.3 料液比对多酚得率的影响

由图3所示,当料液比在1∶5～1∶20时,蓝莓果渣中的多酚含量逐渐增多;当料液比为1∶20时,多酚的得率最大,为(8.04±0.16) mg/g;这是当在溶剂用量达一定程度时,多酚的溶出接近饱和,提取量不会随料液比的增大而增加;当料液比大于1∶20时,多酚得率逐渐下降,因为当溶剂的用大时,体系在振荡过程中会增加溶剂的含氧量,导致多酚被氧化,同时扩散到溶剂里的多酚类化合物越多,吸附作用增强导致多酚含量降低,而且从经济角度考虑料液比增大会提高提取剂成本[20]。

图3 料液比对多酚得率的影响Fig.3 Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols

2.4 酶用量对多酚得率的影响

由图4所示,纤维素酶用量逐步增加,蓝莓渣中的多酚得率先增加至最大值后缓慢降低,当纤维素酶用量为5 mg/g时,多酚得率达到最高,为(8.10±0.13) mg/g;当纤维素酶用量大于5 mg/g时,多酚得率开始下降。这是因为纤维素酶的作用,会加快破坏细胞壁的结构,从而促进了蓝莓果渣中细胞内多酚类物质的释放,但是当纤维素酶的数量达到一定数值后,酶水解的底物达到饱和,过量的酶分子会聚集在细胞周围,进而影响多酚类物质的扩散,造成多酚得率的降低。因此,纤维素酶最佳用量为5 mg/g。

图4 酶用量对多酚得率的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on polyphenol yield

2.5 初始pH对多酚得率的影响

由图5所示,当初始pH位于4.0～4.8时,蓝莓果渣中的多酚得率随着pH的增大而显著提高,当初始pH为4.8时,蓝莓果渣中的多酚得率最大,为(8.06±0.13) mg/g;当初始pH大于4.8时,随着pH的增加,蓝莓渣中多酚的含量开始下降。这主要是由于初始pH为4.8时纤维素酶的活性大,当初始pH较高或较低时,酶活性会受到影响,降低纤维素酶的酶解效率,从而造成蓝莓果渣中多酚含量的下降。因此,得出试验中初始pH为4.8为宜。

图5 初始pH对多酚得率的影响Fig.5 Effects of initial pH on the yield of polyphenols

2.6 提取温度对多酚得率的影响

由图6所示,当提取温度在40～50 ℃下,蓝莓果渣中的多酚得率逐渐升高;当提取温度达到50 ℃时,蓝莓果渣多酚得率达到最高,为(8.08±0.1) mg/g;当提取温度超过50 ℃时,蓝莓果渣中的多酚得率呈缓慢下降趋势。考虑到纤维素酶的最佳温度和试验成本,选择提取温度为50 ℃比较适宜。当温度超过50 ℃,蓝莓多酚含量没有明显的降低,因此提取温度不作为考察因素,在响应面试验中固定提取温度为50 ℃。

图6 提取温度对多酚得率的影响Fig.6 Effects of temperature on the yield of polyphenols

2.7 响应面试验结果分析

2.7.1 响应面设计 采用Design-Expert 8.0.6软件,利用Box-Behnken中心设计原理,以蓝莓果渣中的多酚得率作为响应值,在单因素试验的基础上选择对多酚含量影响较大的3个因素A(液料比)、B(pH)、C(酶用量)进行响应面设计,进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合设计,结果如表2所示。

表2 响应面设计及试验结果Table 2 Response surface design and test results

2.7.2 回归方程的确定和方差分析 通过响应面分析软件对表2中的试验数据进行分析,得到蓝莓果渣多酚得率(Y)的二次多项拟合方程：Y=8.11-0.051A+0.019B+0.21C-0.12AB+0.12AC+0.19BC-0.39A2-0.42B2-0.54C2。

对回归模拟进行方差分析,由表3可知,F=165.34,P<0.000 1说明试验中采用的回归模拟是极其显著的。失拟项P=0.059 0大于0.05,即失拟项是不显著的,说明方程拟合的较好。因此,可以用该模型代替试验实际操作对试验结果进行预测。

由表3可以看出,其中C(酶用量)在试验研究过程中对多酚得率的影响是极显著的,A(液料比)对多酚得率的影响是显著的,只有B(pH)是不显著的,而在交互项和二次项中的各项均是极显著的。另外由各因素的F值大小可以看出,对响应值多酚得率影响最大的是纤维素酶的用量,其次是料液比,最后是pH。

表3 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis of response surface test

2.7.3 响应面最佳工艺条件的确定 根据单因素试验结果,选择合适的试验数据,分析料液比(A)、pH(B)、酶用量(C)对蓝莓果渣中多酚得率的影响,并作出AB、AC、BC的响应面分析图及等高图。由图7～8可以看出,蓝莓果渣中多酚得率在料液比为1∶20、初始pH为4.8时达到最大值。从响应面三维图可以看出,料液比的曲面变化比较大,说明料液比对多酚得率的影响比pH大,这与方差分析结果相一致。由图9～10可知,响应面三维图中蓝莓果渣中多酚的得率随料液比和酶用量的变化都是先增加后降低,在料液比为1∶20,酶用量为6 mg/g时,蓝莓果渣中多酚的得率达到最高,分析等高线图可以发现,酶用量所在轴向的等高线较为密集,而料液比所在轴向的等高线较为稀疏,二者相比较,说明酶用量对多酚得率的影响更大。由图11～12可知,响应面三维图中蓝莓果渣中多酚的得率随着pH和酶用量的变化都是先升高然后再降低。在初始pH为4.8,酶用量为6 mg/g时蓝莓多酚得率达到最大。从等高线图可以发现,酶用量所在轴向的等高线更为密集,说明酶用量对多酚得率的影响较大,而pH所在轴向的等高线相对稀疏,说明pH对多酚得率的影响较小,这与方差分析的结果一致。而二者的等高线图的形状呈椭圆形,说明酶用量和pH之间有显著交互作用。综上,果渣多酚提取的最佳工艺条件是料液比为1∶19.77、pH为4.83、酶用量为6.80 mg/g,在此条件下,蓝莓果渣中多酚得率达到最高,为8.130 6 mg/g。

图7 A与B对多酚得率影响的响应面三维图Fig.7 Response surface three-dimensional diagram of the effect of A and B on the yield of polyphenols

图8 A与B对多酚得率影响的响应面等高线Fig.8 Response surface contour of the effect of A and B on the yield of polyphenols

图9 A与C对多酚得率影响的响应面三维图Fig.9 Response surface three-dimensional diagram of the influence of A and C on the yield of polyphenols

图10 A与C对多酚得率影响的响应面等高线Fig.10 Response surface contours of the effect of A and C on the yield of polyphenols

图11 B与C对多酚得率影响的响应面三维图Fig.11 Response surface three-dimensional diagram of the effect of B and C on the yield of polyphenols

图12 B与C对多酚得率影响的响应面等高线Fig.12 Response surface contours of the effect of B and C on the yield of polyphenols

3 结论

本研究获得蓝莓果渣中多酚最佳提取工艺(料液比为1∶19.77、pH为4.83、酶用量为6.8 mg/g),蓝莓果渣多酚得率为8.130 6 mg/g。目前,提取蓝莓多酚的常用方法包括有机溶剂法、超声波辅助法、微波辅助提取法,有机溶剂法存在试剂残留、安全隐患问题,超声波辅助浸提和微波辅助浸提所用的设备技术和经济成本高,采用酶法提取的最大优势是反应条件温和,蓝莓多酚在提取过程中几乎不损失,有效成分的提取量高;同时所得产物纯度、稳定性、活性均较高,且无污染。此外,酶法还具有缩短提取时间、降低能耗、降低生产成本等优势。考虑到实际操作过程的准确性,对此工艺进行进一步修改,修改后的工艺条件为：液料比为1∶20,pH为4.8,酶用量为6.8 mg/g,浸提温度为50 ℃,浸提时间为6 h。在该工艺条件下,测得蓝莓果渣中多酚的得率为8.130 6 mg/g。该工艺过程操作简单,得率较高,适合蓝莓果渣多酚提取的实际生产,可以提高蓝莓副产物的利用率。