肖 兵,黄家梦,陆晓民

(安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100)

镉(Cd)是最常见的重金属之一,对植物和动物等生物体具有剧毒,很容易被植物根系从土壤中吸收,然后进入食物链,对动物和人类健康构成潜在威胁[1-2]。针对镉污染的土壤,主要有物理、化学和微生物修复方法,相比之下,微生物修复是一种更环保、更具成本效益的方法[3-4]。

在自然界中,植物被大量的微生物定殖,其中土壤微生物在维持植物健康、生产力调节、激素内稳态、帮助宿主植物适应有害环境等方面发挥着重要作用[5-6]。微生物介导的植物激素状态变化主要是与乙烯等挥发性化合物的形成有关[7-8]。由于很难监测水稻内生菌的生理状态,所以水稻内生菌对植物抑制镉吸收的机制尚不清楚。该研究报道了水稻内生菌Pseudomonassp.LP20对水稻镉吸收的影响,进一步探讨了该菌株提高水稻抗镉能力的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水稻品种 日本晴(OryzaSativaL.spp.japonica)由安徽省农业科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻培养和菌种分离鉴定 使用2.5% NaClO溶液对水稻种子表面消毒15 min,然后用无菌水冲洗5次。将灭菌后的种子置于黑暗条件下3 d,然后移至无菌营养液(1.43 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、1.43 mmol/L (NH4)2SO4、2.14 mmol/L CaCl2、1.34 mmol/L KH2PO4、1.02 mmol/L K2SO4、1.65 mmol/L MgSO4·7H2O、0.10 mmol/L Na2SiO3·9H2O、9.10 μmol/L MnCl2·4H2O、0.52 μmol/L(NH4)6MO7O24·4H2O、18.5 μmol/L H3BO3、0.15 μmol/L ZnSO4·7H2O、0.16 μmol/L CuSO4·5H2O、35.8 μmol/L EDTA-Fe)。水培试验在30 ℃/22 ℃(白天/夜晚)生长室中进行,光照和暗光周期分别为16、8 h。

在镉胁迫的土壤(50 mg/kg Cd)中种植水稻,分离细菌菌株。取约1.0 g根样品用2.5% NaClO溶液消毒10 min,用无菌水研磨,并在含有100 μmol/L CdCl2的LB琼脂平板上培养36 h。通过16S rRNA基因对比测序对细菌鉴定。为研究耐镉细菌对水稻植物镉胁迫的抗性影响,LP20最初在含有5.0 g/L NaCl、5.0 g/L酵母提取物和10.0 g/L胰蛋白胨培养。随后将细菌悬浮液转移到含有和不含80 μmol/L CdCl2无菌营养液的水培箱中。每个盒子16株幼苗,分为4种处理：野生型、含LP20(-Cd+LP20)、含镉(+Cd)以及装有镉和LP20 (+Cd+LP20)的盒子,每个处理3个重复。

1.2.2 叶绿素含量和乙烯测定 取0.5 g新鲜叶子浸入20 mL 80%丙酮中,室温避光保存24 h,将提取液以12 000 r/min离心10 min,测定叶绿素含量[9]。将水稻根转移到装有1 mL无菌水的10 mL玻璃瓶中,立即密封,在黑暗条件下30 ℃培养5 h,然后将1 mL空气体注入气相色谱仪(Focus GC,Thermo,United States)分析乙烯含量。根据根样品的鲜重(FW)计算乙烯的总量[10]。

1.2.3 水稻镉含量测定 用无菌去离子水、5 mmol/L CaCl2和5 mmol/L EDTA对茎和根样品连续冲洗,80 ℃下烘干24 h。将0.5 g植物组织用HNO3-HClO4(体积比为4∶1)混合液180 ℃下消化3 h,用原子吸收光谱仪检测植物组织中的镉浓度。

1.2.4 ACC脱氨酶活性筛选 LP20在LB液体培养基中培养24 h,以8 000 r/min离心10 min。洗涤沉淀物并重新悬浮在无菌水中。将细菌悬浮液稀释并在3 mmol/L ACC代替(NH4)2SO4的ADF培养基上培养。28 ℃下培养3 d,生长的细菌菌落为产ACC脱氨酶的细菌[11]。

2 结果与分析

2.1 Pseudomonas sp.LP20对水稻镉抗性的影响

在Pseudomonassp.LP20处理的情况下,将10日龄的水稻幼苗移植到含有80 μmol/L CdCl2的营养液。结果显示,LP20对非镉胁迫下水稻生长没有明显影响,而接种LP20对镉胁迫水稻植株的鲜重和株高明显高于未接种植株。同时发现镉胁迫条件下水稻植株的叶绿素含量显著降低,而接种LP20植株的叶绿素含量保持相对较高(图1)。为进一步探究,在镉胁迫处理2周后分析水稻镉含量变化,发现水稻植株的茎和根中镉含量显著增加,而接种LP20的水稻植株的茎和根部镉含量显著降低(图2)。

图1 LP20对水稻镉胁迫下生物量的影响Fig.1 Effects of LP20 on biomass of rice under stress

图2 LP20对水稻镉含量的影响Fig.2 Effects of LP20 on cadmium content in rice

2.2 Pseudomonas sp.LP20对乙烯生物合成的影响

乙烯可以激活水稻植物中铁吸收相关基因的转录,这些基因的高水平表达会增强镉的吸收,从而加剧镉的毒性,因此LP20诱导水稻对镉的抗性可能是由于乙烯生物合成受到抑制进而影响植株镉的吸收。接种LP20用80 μmol/L CdCl2处理10日龄水稻幼苗3 d ,发现与未处理的水稻相比,镉处理的水稻根系乙烯水平显著增加,而LP20接种植物的根部乙烯含量明显低于未接种植物(图3A)。为进一步研究在3 mmol/L ACC作为唯一氮源的ADF培养基中检测LP20的ACC脱氨酶活性,结果显示菌株不能在培养基上生长,说明LP20不能产生ACC脱氨酶。为了证实乙烯参与LP20诱导水稻镉抗性的假设,检测了LP20对用乙烯生物合成前体ACC(50 μmol/L)处理的水稻植株镉积累的影响。如图3所示,ACC处理后植株生物量、株高和叶绿素含量显著降低,说明ACC消除了LP20缓解水稻植株镉毒性的作用。

2.3 LP20对葡萄糖醛酸分泌的影响

经HPLC分析,在LP20的细菌培养物中葡萄糖醛酸(GA)的含量随时间逐渐增加(图4A),表明LP20是一种产生葡萄糖醛酸的细菌。与对照组相比,镉胁迫条件下,接种LP20的根积累的葡萄糖醛酸水平显著高于对照组(图4B)。

图4 LP20对葡萄糖醛酸分泌的影响Fig.4 Effects of LP20 on glucuronic acid secretion

2.4 葡萄糖醛酸对水稻镉胁迫的影响

如图5所示,葡萄糖醛酸处理显著提高了水稻植株对镉的抗性,鲜重和叶绿素含量显著增加,水稻植物的茎叶和根部镉含量显著低于对照组。同时也可以观察到葡萄糖醛酸诱导的水稻植株对镉的抗性在很大程度上被ACC削弱,相反乙烯生物合成抑制剂AVG增强了水稻植株对镉胁迫的抗性。

图5 葡萄糖醛酸对植物镉胁迫响应的影响Fig.5 Effects of glucuronic acid on plant response to cadmium stress

3 结论与讨论

重金属污染在农田中普遍存在,严重威胁着食品安全。由于土壤净化的难度和成本较高,迫切需要制定低价环保的方法来处理农业生态系统中的重金属污染[12]。该研究验证了内生细菌可以通过调节激素平衡来限制植物对镉的吸收。发现在镉胁迫条件下接种Pseudomonassp.LP20水稻植株的鲜重和株高明显高于未接种植株,水稻植株的叶绿素含量显著降低,而接种LP20植株的叶绿素含量保持相对较高。

大量文献表明乙烯对植物缓解重金属毒害有重要作用,其中微生物通过增加或降解植物激素含量途径越来越受到人们关注[13-14]。本实验研究发现,接种内生菌LP20植物的根部乙烯含量明显低于未接种植物,ACC处理后水稻植株生物量、株高和叶绿素含量显著降低,说明ACC消除了LP20缓解水稻植株镉毒害的作用。然而用内生菌LP20产生的葡萄糖醛酸(GA)处理植株发现相同结果,植株鲜重和叶绿素含量显著增加,茎和根部镉含量低于对照组。同时也可以观察到葡萄糖醛酸诱导的水稻植株对镉的抗性在很大程度上被ACC削弱,相反乙烯生物合成抑制剂AVG处理却增强了水稻植株对镉胁迫的抗性。

综上,内生菌LP20通过分泌葡萄糖醛酸抑制乙烯生物合成从而减少水稻根系中镉的积累。