俞丽云,胡能兵*,陈绩峰,张雅庭,郭红艳,邓莲玉,张雪平

(1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100;2.南京天香菊生物技术有限公司,江苏 南京 210000)

串叶松香草(SilphiumL.)是菊科(Compositae)松香草属(Silphium)多年生宿根草本植物。目前,对串叶松香草的研究主要集中在栽培技术、饲喂效果、药用价值等方面[1]。串叶松香草具有适应性广、抗逆性强、耐高温、耐寒、耐盐碱、产量高、营养丰富等特点,是一种新型饲草绿肥作物,是多种家畜、家禽和鱼配合饲料及蛋白质补充饲料的重要成分[2]。此外,串叶松香草也是水土保持、防风固沙、退耕还草和生态环境建设的首选草种[3-4]。串叶松香草中还含有大量的生物碱、核黄素、黄酮类和甙类物质[5-7]。从其根茎提取的芳香焦状油有兴奋和抗痉挛、养生的功效,可用作强壮剂和补剂,也可用于发烧、内伤、虚弱、溃疡及肝虚、脾虚等治疗,同时也是药酒、药用乳胶的有效成分[8]。

多倍体育种具有多目标性状的综合改良效果,如植株在生产中表现出来的营养器官和生殖器官增大、营养成分增多、优质、高产、抗逆性强等特征[9-10],对新品种选育具有重大意义。目前通过秋水仙素诱导植株多倍体成功的报道较多,张丞慧等[11]研究发现0.05%的秋水仙素处理幼苗1 d能取得较好的诱导效果;李良良等[12]用100 mg/L秋水仙素处理“红阳”猕猴桃愈伤组织5 h变异率达到23.97%;张晓曼等[13]通过诱导田埂报春获得花大、色艳、植株低矮紧凑的四倍体植株;王真等[14]对半枝莲的种子、茎尖生长点和根尖生长点进行诱变处理,均得到多倍体植株。

将植物组织培养与化学诱变技术相结合是开展无性繁殖作物诱导育种的重要方法[15-18]。本研究在建立离体培养体系基础上,采用秋水仙素浸泡法筛选最佳诱导串叶松香草多倍体的浓度和处理时间,以期建立高效的串叶松香草多倍体诱导体系,创新种质资源为后期育种利用提供技术基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料为串叶松香草二倍体种子,由南京天香菊生物技术有限公司提供。

1.2 串叶松香草植株再生和多倍体诱导试验方法

1.2.1 育苗 将当年采收的串叶松香草的成熟种子,用洗衣粉水洗涤种子表面,流水冲洗30 min,放入超净工作台中紫外处理30 min;浸泡在75%乙醇2 min后;用0.1% HgCl2溶液浸泡,振荡(150 r/min,28 ℃)培养3 min,用无菌水涤荡种子5次,用滤纸吸收种子表面水分并浸泡20 h。接入已灭菌的MS培养基内,培养14 d。

1.2.2 离体生长点诱导植株再生 将基质瓶内培养14 d的苗用无菌水清洗4～5遍,仅保留生长点位置,分别转接在再生培养基上,MS培养基内添加8 g/L琼脂和30 g/L蔗糖,pH为6.0,每种培养基16个生长点,3次重复,暗培养14 d后转入光培养。光照时间为14 h/d,光照强度为3 000 lx,培养温度为(25±2) ℃,36 d统计不定芽增殖情况。

1.2.3 离体植株生根培养 将分化出的组培苗作为外植体材料,以1/2MS为基础培养基,采用3种同一浓度不同类型的激素作生根培养基,培养基内添加8 g/L琼脂以及30 g/L蔗糖,pH为6.0,每种培养基15个生长点,3次重复,暗培养14 d后转入光培养。其他培养条件同离体生长点诱导植株再生,20 d统计植株生根情况。

1.2.4 秋水仙素诱导处理 用离体再生外植体的生长点位置,筛选出外植体在不同诱导时间(6、12、24 h)和不同诱导剂处理质量分数(0.02%、0.05%、0.1%)的最理想诱导方案,使用摇床振荡处理(150 r/min,28 ℃),将各处理的外植体用无菌水冲洗4～5遍,继代到最适增殖培养基内诱导并观察其生长状况。

1.2.5 移栽 以秋水仙素加倍处理生根后的组培苗来完成炼苗试验,当组培苗苗长4 cm、根长4 cm时,移至育秧盘内,炼苗3 d后移到盆内,炼苗45 d后分别对成苗的叶片进行细胞学观察和对根尖染色体数目观察。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 气孔保卫细胞和叶绿体观察 用镊子撕取一小块叶片,下表皮朝上制片,用OLYMPUS生物显微镜(40×)观测串叶松香草不同倍性的气孔保卫细胞和叶绿体数目,每个叶片统计5个视野的气孔数目,取平均值作为气孔密度,测量5个气孔的长度、宽度以及叶绿体的个数,重复3次。

1.3.2 叶片厚度测量 选取新鲜叶片,平放在载玻片上,用刀片切取宽为0.5 cm中央带有主脉的长方形小块叶片。每个叶片切割3次成薄的叶片,制片,用OLYMPUS生物显微镜观察叶片厚度,重复3次,取平均值。

1.3.3 根尖染色体数观察 每个植株剪取3个1.5 cm秋水仙素处理后串叶松香草的根尖,将解离完成的根尖用无菌水漂洗,用改良的苯酚品红溶液染色,常规压片,重复3次。选取染色体分散、清晰的细胞,使用OLYMPUS生物显微镜观察染色体条数,对照为二倍体(2n=2x=14)。

1.3.4 聚类分析 从串叶松香草下表皮的保卫细胞长、保卫细胞宽、气孔密度、叶绿体数目及叶片厚度等进行聚类分析。

1.3.5.数据处理 用Microsoft Excel整理试验数据,用DPS 9.05进行相关性和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素对串叶松香草离体生长点再生的影响

将种子接种至已灭菌的基质中,待生长14 d后,将剪下的生长点接种于T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9培养基上进行再生培养,15 d后外植体的基部和底部开始分化成芽,36 d基部和底部的芽分化成壮苗。经Duncan多重比较结果表明,9种培养基之间差异呈显著水平,T2增殖系数为5.5,为最佳分化培养基(表1)。植物的不同组织和器官都有可能作为外植体进行组织培养诱导成苗,但培养效果存在差异[19-21]。李先芳等[22]以串叶松香草幼叶叶柄、子叶和胚轴作为外植体,通过愈伤组织分化成苗。史向远等[23]研究以串叶松香草新生生长点易诱导成芽,所以本研究以新生生长点为外植体。结合图1可看出,添加TDZ,前期分化能力强,但易形成愈伤,不利于后期分化成芽,而添加6-BA的效果显著优于添加KT和TDZ的效果,苗壮且从芽生长旺盛,可以判断6-BA在串叶松香草的分化成芽中起着关键作用。

图1 串叶松香草离体再生Fig.1 In vitro regeneration of Cup Plant

表1 不同培养基对生长点离体再生的影响Table 1 Effect of different media on the regeneration of growth points in vitro

2.2 不同类型激素对串叶松香草生根的影响

待组培苗长至4 cm时,转至生根培养基内,组培苗基部第8天开始出现米白色突起,有根原基发生(图2),20 d时外植体生根率最高可达80%以上。方差分析结果表明,CSG1与CSG2和CSG3之间差异显著且CSG1的生根率最高平均为89.0%,其为最佳生根培养基。从表2可知,CSG1根长,根壮,侧根分生多,地上部生长良好,其平均根长为4.2 cm左右,根系生活力强;CSG2愈伤生根,根壮,根长,地上部生长一般;CSG3愈伤生根,根短,地上部生长弱。其中CSG1和CSG2的幼苗移栽成活困难。

表2 不同培养基对串叶松香草生根的影响Table 2 Effect of different media on rooting of Cup Plant

图2 串叶松香草生根(CSG1)Fig.2 Rooted Cup Plant

2.3 秋水仙素浓度和处理时间对串叶松香草再生植株诱导的影响

通过人工诱导多倍体是创建植物新种质的重要途径之一,同时也是一种重要的植物育种手段[24-25]。在植物多倍体离体诱导中,不同植物材料的不同部位所采用的秋水仙素的最佳处理方式、处理时间以及处理浓度,需要根据大量的试验数据分析来确定[26-29]。经过离体培养诱导的多倍体可用于生药材使用或直接栽培研究,同时植物在多倍化后一般都会呈现巨大型,其内在的有效成分可能随着染色体的增加而产生变化,为研究多倍体串叶松香草的内在有效成分提供了一定的基础[30]。

由表3可以看出,秋水仙素在不同处理浓度和不同处理时间下,增殖系数随着浓度的升高和时间的增加开始减少,且死亡的外植体数逐步升高。当处理浓度为0.02%,摇床处理时间为24 h,外植体材料致死率达到90%;当秋水仙素处理浓度达0.2%,摇床处理时间为6 h,致死率达50%,且增殖系数为2.50左右。

表3 秋水仙素不同浓度和处理时间对串叶松香草生长点再生的影响Table 3 Effects of different colchicine concentrations and treatment times on the regeneration of growth points of Cup Plant

2.4 不同倍性植株组培苗细胞学和形态学观察与鉴定

本研究先通过形态学观察法,但从这单一性状来分析过于片面,故再采用表皮气孔保卫细胞法,通过观察比较二倍体和四倍体叶绿体数量(图3),后者叶绿体数量显著增加,可以对四倍体材料进行初步鉴定。

图3 串叶松香草二倍体(左)和四倍体(右)保卫细胞内叶绿体比较Fig.3 Comparison of chloroplasts in guard cells of diploid (left) and tetraploid (right) of Cup Plant

采用浸泡法处理组培苗并使其生根,共出苗262株,移栽后成活210株,成活率达80.2%,通过细胞学鉴定观察,结合表4可以看出,四倍体部分材料的保卫细胞长和宽显著大于二倍体,但四倍体的气孔密度减小。由于串叶松香草无明确的品种,每个单株之间的株高形态差异较大,故仅对串叶松香草的叶片厚度进行测量。由表4可知,四倍体材料与二倍体材料的叶片厚度差异不显著。目前,根据串叶松香草内的保卫细胞长、气孔密度、叶绿体数目以及叶片厚度等差异分析可以初步判定有15份多倍体材料,但若要确定其倍性还需进一步进行根尖染色体的倍性鉴定。

表4 二倍体及多倍体串叶松香草的叶片厚度与表皮气孔保卫细胞特征比较Table 4 Comparison of leaf thickness and epidermal stomatal guard cell characteristics in diploid and polyploid Cup Plant

2.5 根尖染色体数比较

通过细胞显微镜对根尖染色体数进行3次重复观察,结果表明,串叶松香草二倍体植株的根尖细胞染色体数目为2n=2x=14(图4A);使用OLYMPUS生物显微镜观察染色体条数,鉴定其染色体数目为2n=4x=28(图4B),进一步确定15份变异植株为串叶松香草四倍体植株。由此可判定根尖染色体数目观察鉴定结果与细胞学鉴定结果一致,所以诱导率可达7.14%,但部分四倍体植株从外观形态方面也未展现出巨大性,原因需尚待研究。

图4 串叶松香草二倍体(A)和四倍体(B)根尖染色体Fig.4 Diploid (A) and tetraploid (B) root tip chromosomes of Cup Plant

2.6 不同倍性植株组培苗细胞学和形态学的聚类分析

由于串叶松香草属于异花授粉且杂合的植物,且串叶松香草无明确的品种,每个单株之间差异较大,故不仅二倍体植株与四倍体植株之间显著差异,四倍体植株的细胞和形态之间也存在差异,因此分别对16份串叶松香草的二倍体和四倍体的细胞学和形态学性状进行系统聚类分析(图5),聚类树形图直观的反应了不同资源在叶片上细胞形态特征上的相似性。

图5 串叶松香草细胞形态学聚类Fig.5 Cytomorphological clustering of Cup Plant

在欧式距离5.27处作等级结合线可将16份资源分成4大类,分别为CK、JC1、JC2、JC3。将CK单独聚类,37、72分为JC1类,53、137、56、128、79、185、100分为JC2类,110、123、154、174、210、201分为JC3类,其中CK类为二倍体,JC1、JC2和JC3类为四倍体。由表5可看出,在保卫细胞长中,JC1类和JC3类分别显著高于CK和JC2,但二倍体CK与四倍体JC2无显著差异。而在保卫细胞宽内,JC2类显著高于其他3类,可以判断四倍体叶片在保卫细胞的宽上无明显加倍现象。CK类的气孔密度显著高于四倍体JC1、JC2、JC3类。从叶绿体数目可以看出四倍体JC1类、JC2类、JC3类显著高于二倍体植株,结合图3可看出串叶松香草植株加倍后,其叶绿体数目明显增加。JC1、JC3类的叶片厚度显著大于JC2类、JC2类的叶片厚度显著大于CK类。

表5 串叶松香草细胞形态学聚类分析Table 5 Clustering analysis of the cell morphology of Cup Plant

3 结论与讨论

本研究获得串叶松香草组培快繁最适的增殖培养基为MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA,以及最适的生根培养基为以1/2MS为基础培养基不添加任何外源激素。在建立组培体系基础上,以0.2%秋水仙素浸泡处理6 h作为诱导串叶松香草多倍体最佳处理浓度和时间,诱导率可达7.14%。

目前,多倍体鉴定方法主要有形态鉴定法、细胞学鉴定法、分子标记鉴定法、染色体计数和流式细胞术检测法等[31-33]。最常用的鉴定方法为流式细胞术检测和染色体计数,可以简化鉴定步骤和降低鉴定成本,另外多倍体植物一般“巨大性”表现明显[34-36],故先通过表皮气孔保卫细胞法和形态观察法,再进行根尖染色体数观察,不仅简化了诱导的技术环节,还成功获得串叶松香草的15份同源四倍体新材料,为串叶松香草创新种质资源,提高育种价值。针对串叶松香草本身品种的差异,对二倍体与四倍体植株以及四倍体植株之间进行聚类分析,为以后的优良品种筛选和鉴定给予一定的技术支撑。