周向平 陈 武 刘天波 王运生 王凯歌刘 峰 李小慧 袁志辉

（1湖南省烟草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；3湖南省烟草科学研究所，湖南 长沙 410004；4湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南 永州 425199；5湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425199）

青枯病是由青枯劳尔氏菌（Rasltonia solanacearum，简称青枯菌）引起的一种毁灭性土传病害，青枯菌寄主范围广泛，可侵染包括茄科植物在内的400 多种植物［1］，包括重要的粮食、经济和蔬菜作物。青枯病菌主要通过土壤传播并侵染寄主根系，然后在导管中大量繁殖，使导管堵塞，水分运输受阻，进而使地上部因缺水萎蔫而枯死［2］。细菌性维管束病害所具有的致病机理使青枯病难以防治，是农作物特别是茄科作物如番茄、辣椒、马铃薯和烟草等生产上的重要限制因子，已造成不可挽回的经济损失［3-4］，使得青枯病成为世界上较为严重的植物细菌性病害之一。

二十世纪末至今，大量田间-温室试验已经广泛评估了轮作、嫁接、土壤改良剂、土壤熏蒸、化学防治等方法对青枯病的防控作用［5］。但每种方法都存在明显的缺陷，如轮作模式周期长，对灌溉资源要求高，会减少有效种植面积；土壤改良剂可选择的种类少，对土壤结构破坏大，且防控效果不能满足实际生产要求等。生物防治具有安全无公害、长效等优点，是当前防控青枯病的研究热点，如赖宝春等［6］采用复合拮抗放线菌的方式防治番茄青枯病的盆栽防效可达82.03%；蔡傅红等［7］采用的伊利石吸附W51 菌剂在温室试验中对番茄青枯病的防效为62.29%，表现出了较好的防治效果。生物防治的作用机制可分为竞争营养和生态位、分泌抑菌活性物质、寄生（寄生病原菌，如噬菌体等）和诱导寄主产生系统性抗性等，其中分泌抑菌活性物质被认为是生防菌抑制病原菌的主要作用机制［8］。

前期研究结果表明，湖南农业大学植物保护学院作物病虫害防控实验室从烟草根系土壤中筛选到的短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）B011 的无菌发酵液对青枯病菌有良好的拮抗活性，说明B011具有合成并分泌抑菌活性物质至胞外的能力。拮抗菌的抑菌活性物质主要来源于核糖体合成和非核糖体合成两大途径［9-10］。目前，从短短芽孢杆菌中纯化并鉴定的具有抑菌活性的次生代谢产物主要是抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）和非核糖体肽（non-ribosomal peptides，NRPs）［11-12］。其中，典型的AMPs均由核糖体合成，包括侧孢霉灵（laterosporulin）、侧孢霉灵10（laterosporulin10）和Bac-GM100 等［11］。NRPs 则包括线性NRPs （linear NRPs）、环状NRPs （cyclic NRPs）、线性脂肽（linear lipopeptides）和环脂肽（cyclic lipopeptides）等四类数十种化合物［11-12］。从数量上看，短短芽孢杆菌合成的主要抑菌活性物质是非核糖体肽类抗生素，其次是传统的抗菌肽［13］。

在短短芽孢杆菌抑菌活性物质的相关研究中，一般止于分离和结构鉴定，对其合成基因和途径的预测和研究较少。因此，本研究采用阳离子交换树脂柱对B011的发酵液中的抑菌活性物质首先进行粗分离与富集，然后通过高效液相色谱法进一步分离纯化抑菌活性物质，再利用质谱与核磁波谱法解析其结构，最后根据基因组序列预测活性化合物的生物合成途径及其相关基因，以期建立抑菌活性物质和编码基因簇的对应关系，为后续解析其生物合成途径及通过合成生物学方法进行定向改造奠定基础，也为探讨抑菌活性物质在作物病害生物防治方面的应用前景提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearumGMI1000）由湖南农业大学植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室提供。短短芽孢杆菌B011（Brevibacillus brevisB011）为湖南农学大学植物保护学院作物病虫害防控实验室（本实验室）自行分离、鉴定和保存的菌株。

1.2 仪器和材料

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、甲醇、乙腈、无水乙醇、甲酸、三氯乙酸、异丙醇、氢氧化钠和盐酸等均购自中国医药集团有限公司（北京），其中甲醇和乙腈为色谱纯，其他均为分析纯。

改良NA培养基（NB固体培养基：牛肉膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂粉15 g、加蒸馏水定容至1 000 mL、pH值7.2）用于培养短短芽孢杆菌菌株B011。

高效液相系统：50 mm×250 mm DAC Column 和LC6000 型制备高效液相色谱仪（色谱仪配备P6000 高压制备泵和紫外检测器），北京创新通恒科技有限公司；C18HC 色谱柱、C18M 开放柱，北京华谱新创科技有限公司；HPLC-QTOF/1290-6530 液相质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 菌种的发酵及发酵液前处理

将B011 在NA 培养基上划线活化，挑单菌落接种NB液体培养基，30 ℃、180 r·min-1条件下过夜培养后按5%的接种量将种子液接种于50 L 发酵罐（35 L 培养基），30 ℃、160 r·min-1条件下发酵培养48 h 后放罐。B011发酵液选用截留孔径为5 kDa的中空纤维素膜过滤，同时去除菌体和分子量大于5 kDa的物质。

1.4 B011发酵液中抑菌活性物质的分离、纯化与鉴定

将处理后的发酵液上阳离子交换树脂柱，吸附材料为D113大孔弱酸性阳树脂。洗脱体系由6个步骤组成：①用3.7 mol·L-1HCl溶液活化大孔吸附树脂，随后用蒸馏水冲洗至pH 值呈中性；②再用2～3倍柱体积的1.00～1.25 mol·L-1NaOH 活化树脂，随后用蒸馏水冲洗至pH值呈中性；③将经中空纤维素毛细管膜过滤后的发酵液上柱，弃滤过液；④用0.1%甲酸溶液冲洗大孔吸附树脂柱，弃滤过液；⑤用5%甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，闪蒸或喷雾干燥，即为抑菌活性物质的粗分离样品，避光低温保存备用；⑥按第①和第②步骤活化树脂，进入下轮处理。

1.5 抑菌活性物质的纯化与鉴定

将B011发酵液的粗分离冻干粉溶于去离子水超滤，上样于H型阳离子交换树脂，洗脱剂依次为去离子水、1%氨水、3%氨水。对青枯菌的抑菌活性测试结果表明，3%氨水部分为具有抑菌活性的馏分。随后将馏分冻干粉溶于工业甲醇中，抽滤后过C8M开放柱，流动相为甲醇。收集液浓缩，去离子水复溶，盐酸调pH值至中性。选择复杂度较低的组分进行活性物质的分离纯化。用分析型C18HC 色谱柱进行分离，流动相为乙腈-0.2%三氟乙酸水、流速（0.65 mL·min-1）和进样量100 µL、紫外检测波长为272 nm。按色谱峰分段收集具有抑菌活性的馏分；减压浓缩和冷冻干燥后得到高纯度的化合物1。流速和进样量保持不变，流动相变更为20%乙腈-0.2%三氟乙酸水，收集单色谱峰馏分，减压浓缩和冷冻干燥后得到高纯度的化合物2。以烟草青枯菌为靶标，采用滤纸片法检测化合物活性。

以烟草青枯病菌为靶标菌，通过滤纸片法观察两个化合物的抑菌活性。化合物1 为水溶液，化合物2 为10%二甲基亚砜水溶液（体积百分比）；化合物1号样品浓度为0.4 mg·mL-1，化合物2号样品浓度为10 mg·mL-1；阴性对照分别为水和10%二甲基亚砜水溶液；阳性对照为B011无菌发酵液，每张滤纸片上载样量为10 µL。

采用液相质谱联用仪分别对纯化获得的两个抑菌活性物质进行三重串联液质分析（liquid chromatography tandom mass spectrometry，LC-MS/MS）。采用BRUKER AVANCE III 600MHz核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）电喷雾质谱法（electro spray ionization mass spectrometry，ESI-MS）对2个抑菌活性物质进行核磁波谱分析（委托青岛菲优特检测有限公司开展），仪器的参数设置按说明书执行。

1.6 活性物质生物合成基因簇的分析

本实验室前期已完成B.brevisB011 基因组测序，GenBank 登录号为CP041767。用antiSMASH（http：//antismash.secondarymetabolites.org/）［14］在线对B011 基因组进行次生代谢产物合成基因簇预测，将已经注释好的B011基因组序列（gbk格式）在线提交到antiSMASH数据库查询，antiSMASH 通过blast 搜索和FPAM 结构域预测，然后与数据库中已知的次生代谢产物合成基因库进行匹配，根据基因序列的相似性和基因排列顺序进行预测。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

2.1.1 化合物1 在ESI-MS：正离子模式下，该化合物的准分子离子峰［M+H］+为755.440 6（图1），推测分子式为C33H58N10O10，实测值与理论值偏差仅为0.78。

图1 化合物1的一级和二级质谱图Fig.1 Mass spectrometry of compound 1

根据一级和二级质谱中各片段分子量的大小，推测化合物1的裂解方式如图2所示。

图2 根据一级及二级质谱结果推测的化合物1的结构Fig.2 The diagram structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 1

该化合物的一维核磁共振数据归属如表1 所示，其核磁共振谱数据与文献［15］的报道基本一致。

表1 Edeine A的核磁信号Table 1 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of edeine A

综合质谱及核磁波谱测试结果，将目标化合物鉴定为伊短菌素A（edeine A），其结构如图3 所示。该化合物外观为白色粉末，分子式为C33H58N10O10，分子量为754.87。

图3 Edeine A的一级结构Fig.3 Structure of edeine A

2.1.2 化合物2 该化合物LC-MS/MS的一级及二级质谱图如图4所示。

图4 化合物2的一级和二级质谱图Fig.4 The mass and tandem mass spectrometry of compound 2

正离子模式下，准分子离子峰［M+H］+的m/z为203.105 2，［2M+H］+的m/z为405.202 6；负离子模式下，准分子离子峰［M-H］-的m/z为201.104 7，推测分子式为C12H14N2O（图5）。

图5 根据一级质谱和二级质谱推测的化合物2的一级结构Fig.5 The structure that deduced by mass and tandem mass spectrometry of compound 2

该化合物的一维核磁共振数据归属如表2 所示，其核磁共振谱数据与文献［16］的报道基本一致。

排除杂质信号后，13C NMR 中共有12个信号：高场区3 个碳信号，1 个亚甲基信号δ 39.6 被溶剂峰掩盖，但可以通过DEPT135°找到，另外两个碳信号δ 22.7和25.3分别为甲基和亚甲基信号；低场区有9个碳信号，δ 169.1 归属于酰胺羰基，其余5 个叔碳和3 个季碳均为芳环上的碳原子。

排除杂质信号后，1H NMR中共有10组信号：δ 10.83（1H，br s）和7.98 （1H，br s）为亚胺活泼质子信号；高场区δ 1.81（3H，s）为孤立甲基质子，δ 2.81（2H，t，J=7.5 Hz）和δ 3.31 （2H，dt，J=6.0，7.5 Hz）为两组亚甲基；低场区有5组芳基质子。

COSY 谱中给出了一系列质子间的相关信息，δ 2.81 和3.31 的相关信号表明两者是A2B2系统中的一对亚甲基，同时δ 3.31与氨基的活泼质子相关，表明该亚甲基与氨基直接相连；不饱和区δ 7.14（1H，br d，J=2.1 Hz）仅与五元吡咯环亚胺质子相关，归属于氮原子的α 位；δ 7.52 （1H，d，J=7.8 Hz）与6.98 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.06 （1H，dt，J=0.8，7.8 Hz）、7.342 （1H，d，J=7.8 Hz）的连续相关信号表明其归属于邻位而取代苯的四组芳基质子。

HMBC 给出质子与碳原子的远程相关信息，芳环上的相关关系符合“间位相关”规律，重要的相关关系如图6所示。

图6 质子与碳原子的间位相关关系图Fig.6 The correlation diagram between proton and carbon atoms

综上所述，化合物2 的一级结构鉴定为N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］，结构如图7。该化合物外观为白色粉末，分子式为C12H14N2O，分子量为202.25。

图7 N-乙酰基色胺的一级结构Fig.7 Structure of N-methylacetylchromate

2.2 化合物的抑菌活性验证

测试结果如图8 所示，浓度为0.4 mg·mL-1的化合物1 的抑菌圈明显大于B011的无菌发酵液，而浓度为10 mg·mL-1的化合物2的抑菌圈小于B011的无菌发酵。说明化合物1是B011合成的主效抑菌活性物质，而化合物2是次要的抑菌活性物质。

2.3 生物合成基因簇分析

2.3.1 次生代谢产物基因簇预测 经antiSMASH 预测，在生防菌B011 基因组中共找到11 个可能与合成活性次生代谢产物有关的基因簇。其中酪氨酸、短杆菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）和petrobactin的合成基因簇都存在于B011 基因组中，且基因簇结构完整。从其分布来看，这些基因簇趋向于分布在一起，如酪氨酸、短杆菌肽（gramicidin）、伊短菌素（edeine）、petrobactin等在基因组上均分布在复制终止子附近。

edeine合成基因簇一共包含17个基因，即edeA～edeQ，其中edeA～edeP位于同一条链，预测属于同一操纵子，而edeQ与其方向相反，位于另一条链上（图9）。与菌株VM4和X23相比，生防菌B011基因组中存在更完整的edeine基因簇，且基因簇中的基因结构完整，基因序列高度保守，在基因编码区和操纵子上游调控区存在一些单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。

图9 不同菌株基因组中Edeine合成基因簇比较分析Fig.9 Comparative analysis of Edeine syntheses gene cluster from different Brevibacillus strains

2.3.2 N-乙酰基色胺的生物合成途径预测及编码基因分析 在产色胺的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereusKVT中，色胺是经由色氨酸脱羧形成的，由色氨酸脱羧酶（tryptophan carboxy lyase）催化产生［17］。故推测在B011菌株中，乙酰色胺的转化途径是色氨酸→色胺→乙酰色胺（图10），关键点由两个酶控制：芳香族氨基酸脱羧酶（aromatic-L-amino-acid decarboxylase，AADC，EC 4.1.1.28）和乙酰转移酶（N-acetyltransferase，EC 2.3.1.5）。

图10 N-乙酰基色胺的生物合成途径预测Fig.10 Biosynthetic pathway prediction of N-acetyltryptamine

在B011基因组中，预测到17个脱羧酶（decarboxylase）编码基因，与参考基因组B.brevisNBRC 100599 比，这17 个基因都能找到相应的同源基因（电子附表1）。脱羧酶（红色）和乙酰转移酶（蓝色）的编码基因在基因组上的位置标注如图11，红圈表示与参考基因组（NBCR100599）比较，颜色越深表示越保守，内圈为GC偏倚（GC Skew）。但这17个脱羧酶基因的注释中并没有芳香族氨基酸脱羧酶功能。同时，本研究在B011基因组中共找到54个乙酰转移酶（acetyltransferase）编码基因的同源基因（电子附表2），其中包括多个氨基酸乙酰转移酶和精胺/亚精胺乙酰转移酶的功能注释，但由哪一个乙酰转移酶负责将乙酰基转移给色胺尚不清楚。

电子附表1 B011基因组中17个脱羧酶编码基因的同源基因信息Electronic Table S1 Homologous gene information of 17 decarboxylase coding genes in B011 genome

电子附表2 B011基因组中54个乙酰转移酶编码基因的同源基因信息Electronic Table S2 Homologous gene information of 54 acetyltransferase coding genes in B011 genome

电子附表2（续）

图11 色氨酸脱羧酶（红色）和乙酰转移酶（蓝色）编码基因在B011基因组上的位置Fig.11 Site information of Homologous gene of decarboxylase（red）and acetyltransferase（blue）in Br.brevis B011 genome

表2 根据HSQC归属的化合物2一维核磁数据Table 2 Results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of compound 2

3 讨论

本研究采用膜过滤和多相色谱等手段，从B011菌株代谢产物中分离纯化得到两个单体化合物，通过高分辨质谱数据和1D、2D 核磁共振谱数据分析，将化合物1鉴定为edeine A，将化合物2鉴定为N-乙酰基色胺。以青枯病菌菌株为指示菌的平皿对峙结果表明，edeine A和N-乙酰基色胺对青枯病菌均有抑菌活性，但前者在低浓度下即具有良好的抑菌活性，是B011分泌的主效抑菌活性物质；而后者在浓度高达10 mg·mL-1时才对青枯病菌有抑菌活性，说明N-乙酰基色胺是B011 分泌的次效抑菌活性物质。

edeine A 是线性非核糖体肽，由4个非蛋白氨基酸［（S）-Tyr/phe、S-Ise、S-A2pr 和（2R，6S，7R）-A2ha］和1个聚胺（N端）组成。edeine是一种广谱的抗生素，对细菌、真菌、支原体和肿瘤细胞均具有抑制活性和免疫调节活性［18-20］，且活性较稳定［21］，在农作物病害防治中有良好的开发与应用前景。edeine家族化合物的抑菌机制具有明显的浓度依赖性，低浓度（＜15 µg·mL-1）下抑制DNA 合 成，高 浓 度（＞150 µg·mL-1）抑 制 蛋 白 质 合成［22］。edeine家族化合物的活性与其氨基酸组成密切相关，Czajgucki 等［19］以edeine A/D 为模板，合成了4 个结构类似物，结果发现，将（2R，6S，7R）-A2ha 替换成（3R，4S）-A2ho或（3R，4S）-A2hp后抑菌活性完全丧失，说明（2R，6S，7R）-A2ha 是影响edeine 家族化合物生物学活性的关键氨基酸之一。这些研究均表明edeine A具有良好的研究和应用价值，同时其活性也可通过结构改造/修饰进行调节。

N-乙酰基色胺可由细菌及真菌合成。前人从放线动孢菌属真菌（Actinokineosporasp.）［14］和被毛孢属（Hirsutellasp.）［23］真菌的发酵液中都纯化到该化合物，且分离到的N-乙酰基色胺具有较强的清除自由基的活性。Pubchem 检索结果表明，N-甲基乙酰色胺（C12H14N2O）不仅可以与甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor）和类固醇受体（steroid receptor）结合并抑制受体的活性，还是线粒体分裂（mitochondrial division）或线粒体融合（mitochondrial fusion）的抑制剂，因此现有研究主要是将N-乙酰基色胺作为药物中间体或前体合成重要的活性化合物或活性天然产物［24］。同时，该化合物对丝状真菌［25］和革兰氏阳性细菌［26］也有抑制活性，但其对革兰氏阴性细菌特别是青枯病菌的抑制活性尚鲜见报道。因此，本研究结果可为N-乙酰基色胺的应用范围拓展和青枯病防控分子的发掘提供理论基础。

本研究分离得到的这两种化合物的生物合成已有少量报道，但对其合成途径目前仍不完全清楚。edeine A的生物合成基因簇在B.brevisVm4［27］、X23［28］和本研究B011的基因组中均已预测到，一些合成调控因子也进行了研究［28-30］，但对其详细的合成机制还缺乏深入研究。N-乙酰基色胺是bacillamides家族前体化合物［31］，对其家族成员化合物如bacillamide C 合成途径的研究［30］有助于阐明N-乙酰基色胺的生物合成机制。N-乙酰基色胺的异源合成［32］也证实了本研究提出的N-乙酰基色胺合成途径，但在B.brevisB011基因组中没有预测到在其合成中起催化作用的芳香族氨基酸脱羧酶［32］和芳烷基胺N-乙酰转移酶［24］编码基因，色氨酸脱羧反应是由这其中某个基因的编码产物催化，还是由其他因子催化有待进一步研究。因此在B011 菌株中N-乙酰基色胺由哪些基因编码的产物催化合成还有待进一步研究。同时，在B011 基因组中的54 个乙酰转移酶（acetyltransferase）编码基因，具体由哪一个乙酰转移酶负责将乙酰基转移给色胺尚不清楚，下一步拟在外源添加色胺的前提下进行B011的表达谱分析，并结合基因敲除及逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）等手段进行验证，以解析N-乙酰基色胺的生物合成途径。

4 结论

本研究发现短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）B011 菌株发酵液中拮抗青枯菌的主效活性物质是伊短菌素A（edeine A），次效活性物质是N-乙酰基色胺［N-（2-（1H-indol-3-yl）ethyl）acetamide］。B011 菌 株基因组中有结构完整的edeine 生物合成基因簇，一共包含17 个基因，序列高度保守；含有乙酰色胺合成途径中关键酶芳香族氨基酸脱羧酶和乙酰转移酶的多个同源编码基因。