王淑华 马艳军，3 姚 娜 范可可 胡晓萌 江泽慧，* 胡 陶，3，*

（1国际竹藤中心/国家林业和草原管理局重点实验室/北京竹藤科技研究中心，北京 100102；2中国林业科学研究院林业研究所/国家林业和草原局林木培育重点实验室，北京 100091；3广西凭祥竹林生态系统国家定位观测研究站，广西 凭祥 532600）

铁皮石斛（Dendrobium candidum）为兰科多年生草本植物，是我国传统名贵药材，同时具有重要的生态价值和观赏价值［1-2］。当前，野生铁皮石斛资源濒临灭绝［3］，在保护铁皮石斛野生资源的前提下培育新品种将有助于石斛产业的发展［4］。60Co-γ 辐射诱变因其成本低、穿透力强、突变率高等优势，与常规育种技术结合，在百合、牡丹、菊花等观赏植物中已得到广泛应用［5-7］。

种子是辐射诱变中常用的材料［8-10］，但目前兰科植物诱变育种中多利用幼苗［11］、根状茎［12］和原球茎［13］作为辐射材料，辐射处理种子的相关研究较少。原因之一在于兰科植物种子细小，较难萌发，辐射对其损伤严重，显著降低其萌发率。有报道表明化学处理（水杨酸、褪黑素、赤霉素等）、光谱处理及激光或微波处理等可在一定程度上缓解植物辐射损伤，并提高其诱变率［14-16］。此外，60Co-γ 辐射会显著降低植物内生真菌种群的多样性，破坏内生真菌群落的稳定性［17］，而对于真菌共生型植物，菌根真菌可增强植物的抗辐射能力［18］。其中铁皮石斛是典型的菌根真菌共生植物，自然条件下菌根真菌对铁皮石斛种子萌发和幼苗生长具有重要作用［19］。

鉴于此，本研究选取显著促进铁皮石斛种子萌发的胶膜菌属菌株JL2、JL4，使其与60Co-γ辐射后的铁皮石斛种子建立共生关系，比较与菌株JL2、JL4 共生萌发和在1/2MS培养基上非共生萌发这两类不同处理条件下，种子萌发率、成苗率的差异，分析菌根真菌对辐射后种子萌发和幼苗生长的影响，探索菌根真菌共生对促进铁皮石斛辐射突变材料的恢复培养和扩繁培养的潜在作用，以期为提高兰科植物种子辐射诱变育种效率提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛（Dendrobium candidum）、建兰（Cymbidiumensifolium）栽培于国际竹藤中心温室，植株生长健康。于2021 年4—5 月对铁皮石斛进行授粉，同年11 月前收集成熟未开裂蒴果（图1-A），于4 ℃条件下保存。

图1 铁皮石斛蒴果与菌根真菌菌落形态Fig.1 Capsules of D.candidum and morphology of mycorrhizal fungi

供试菌株JL2 与JL4 为分离自建兰根部的两株菌根真菌（图1-B、C），将其与铁皮石斛种子共生萌发，为确定菌株在铁皮石斛原球茎中的定殖情况，对其进行真菌特异性染色［20］。

1.2 仪器与设备

YT-CJ-2N 型超净工作台，北京亚泰科隆实验科技开发中心；Axiocam Erc 5s Rev.2.0 体视显微镜，德国Cart Zeiss显微镜有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐射处理 将兰花蒴果表面用75%乙醇擦拭消毒，在超净工作台内剖开分装至1.5 mL 无菌离心管中，在安徽合肥（国家）林业辐照中心进行60Co-γ 辐射处理，辐射剂量为0（CK）、20、40、60、90、120 Gy，剂量率为32.2 Gy·h-1，不同剂量梯度通过辐射时间控制。

1.3.2 辐射后种子萌发 在超净工作台内，用无菌水将各剂量辐射后的种子制成悬浮液，播种于4 种不同条件的培养基。依据是否接种真菌，培养条件可分为非共生萌发［1/2MS培养基（murashige and skoog medium with half strength MS macronutrients）、燕麦培养基（oat meal agar medium，OMA）］和共生萌发（OMA 培养基+菌株JL2、OMA培养基+菌株JL4）。

培养基主要成分如下：1/2MS 培养基［1/2MS +6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）0.5 mg+ α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg+ 蔗糖30.0 g + 琼脂6.0 g +活性炭 0.03 g +去离子水1 000 mL，pH值6.3～6.5］和OMA培养基［1.0 g燕麦粉（Solarbio®，北京）+ 6.0 g 琼脂 + 1 000 mL 去离子水，自然pH 值］。在辐射种子共生萌发中，将各剂量辐射处理种子播于OMA 培养基上，并接种培养7 d 的真菌菌株。每个培养皿中播种800～1 000 颗种子，各处理设3 个重复。培养条件：温度（23±2）℃，光照强度1 600～2 000 lx，光周期14 h光/10 h暗。

1.3.3 菌根真菌的培养与鉴定 菌株JL2（NCBI登录号：OP132532）和JL4（NCBI 登录号：OP132533）培养在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基（Difco，美国）上，（25±2）℃暗培养。

为了确定菌株JL2 和JL4 在胶膜菌属真菌中的分类地位，从NCBI 数据库中下载已报道的胶膜菌属菌株的ITS 序列，采用MEGA-X 软件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树，选用K2 +G模型，设1 000次重复。

1.3.4 铁皮石斛种子萌发率、成苗率统计 参照Stewart等［21］的方法，并进行适当修改，用0～5个阶段对种子萌发和原球茎生长情况进行分级描述，将发育至第2阶段的种子视为萌发（图2），在体视显微镜下统计种子的萌发率和成苗率，计算相对萌发率。

式中，S0～S5分别代表铁皮石斛种子萌发的第0阶段至第5阶段。

1.4 统计分析

利用SPSS 22.0 软件，对不同萌发条件下辐射剂量0（CK）、20、40、60、90、120 Gy 及其对应的种子相对萌发率进行线性回归分析。建立拟合线性回归方程Y= bX+ a，求算参数a、b 的值和决定系数（R2），以检验方程拟合优度；其中，Y为种子相对萌发率，X为辐射剂量；Y=50%时的X值为半致死剂量（LD50）［22］。运用SPSS 22.0 软件，将种子萌发率和成苗率的百分数结果进行反正弦转换：y= sin-1x；将转换后的数据进行方差分析和事后多重比较。当方差齐性时，事后多重比较采用LSD 法；方差不齐时，采用Games-Howell法。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌分子鉴定与定殖观察

由系统发育树（图3）可知，JL2、JL4 为胶膜菌属（Tulasnellasp.）菌株。对与真菌共生萌发的原球茎进行染色，结果表明，真菌菌丝可定殖在原球茎基部细胞内，形成兰科菌根典型的胞内菌丝团结构（图4）。

图3 菌根真菌菌株JL2、JL4的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of mycorrhizal fungi JL2 and JL4

图4 真菌在铁皮石斛原球茎和细胞内的定殖Fig.4 Fungal colonization in D.candidum protocorm and cell

2.2 60Co-γ辐射对铁皮石斛种子萌发的影响

培养50 d 时统计铁皮石斛种子的萌发率，计算相对萌发率。由表1 可知，不同剂量辐射后的铁皮石斛种子在非共生萌发（1/2MS）和共生萌发（菌株JL2、JL4）培养条件下，萌发率均随辐射剂量的升高而降低，其中，20 Gy处理的种子萌发率显著高于其他辐射剂量处理种子萌发率，40 和60 Gy 处理下的种子萌发率差异不显著（表1）；在OMA 培养基上非共生萌发的种子均未萌发；辐射剂量为40、60 和120 Gy 时，与菌株JL2共生萌发的种子相对萌发率最高；辐射剂量为20 和90 Gy 时，非共生萌发（1/2MS）的种子相对萌发率最高。

表1 不同60Co-γ辐射剂量对铁皮石斛种子萌发率的影响Table 1 Effects of different radiation doses on germination rates of D.candidum seeds /%

以表1中6个辐射剂量梯度和相对萌发率为基础，得到1/2MS 萌发条件下的线性回归方程为y=-0.809x+ 100.266（R2=0.962），LD50为62 Gy；与菌株JL2 共生萌发条件下的线性回归方程为y= -0.739x+100.973 （R2=0.946），LD50为69 Gy；与菌株JL4 共生萌发条件下的线性回归方程为y= -0.786x+ 99.253（R2=0.978），LD50为63 Gy（图5）。结果表明，与菌株JL2、JL4 共生萌发的铁皮石斛种子半致死剂量均高于1/2MS培养基上萌发的种子，其中与菌株JL2共生萌发的种子半致死剂量较1/2MS培养基上萌发种子提高了7 Gy。

图5 辐射剂量与相对萌发率的相关性分析Fig.5 The correlation analysis of irradiation dose with relative germination rate

2.3 60Co-γ辐射对铁皮石斛成苗率的影响

分别在培养50 和115 d 时统计铁皮石斛的成苗率，以确定不同培养条件下辐射对早期幼苗形成的影响（表2）。培养50 d 时，在1/2MS 培养基上仅20 Gy 处理有幼苗形成，成苗率为3.02%（图6、表2）；与菌株JL2、JL4 共生萌发条件下，20 Gy 处理种子的成苗率显著高于对照（0 Gy）和其他辐射剂量，分别为11.92%和36.94%，在非共生培养OMA 培养基上所有处理均无幼苗形成（图6、表2）。

培养115 d 时，在1/2MS、JL2 和JL4 三种培养条件下，0 Gy 和20 Gy 处理成苗率差异不显著，但显著高于其他辐射剂量（表2）；在与半致死剂量最接近的60 Gy处理下，石斛种子与菌株JL2、JL4 共生萌发的成苗率显著高于1/2MS 培养基上的种子成苗率（P＜0.05），其中与菌株JL4 共生萌发成苗率可高达3.74%；当辐射剂量提高至90 Gy 时，共生萌发种子的成苗率依然显著高于1/2MS 培养基上萌发的种子（P＜0.05）；在非共生培养OMA培养基上均无幼苗形成，其中0、40、60、90和120 Gy处理种子均处于萌发的第2阶段，而20 Gy处理种子与上述种子相比较为膨大，且部分种子到达原球茎阶段（图6）。由此可见，辐射剂量20 Gy 可促进铁皮石斛快速形成幼苗；与菌株JL2、JL4 共生萌发可显著提升种子在高辐射剂量（＞60 Gy）下的成苗率。

图6 辐射剂量和萌发方法对铁皮石斛种子萌发的影响Fig.6 Effect of various irradiation doses and germination method on the germination of D.candidum seeds

表2 不同60Co-γ辐射剂量对铁皮石斛成苗率的影响Table 2 Effects of different radiation doses on seedling formation rates of D.candidum seeds /%

2.4 60Co-γ辐射对幼苗形态的影响

培养96 d 时，在显微镜下观察不同培养条件下各剂量辐射种子的幼苗生长情况。由图7 可知，与菌株JL4 共生萌发形成的铁皮石斛幼苗长势最好，其中90和120 Gy 处理下幼苗个体较大，表现出叶面积大、假鳞茎粗壮、根系发达（图7）；与菌株JL2 共生萌发条件下，同样表现出90 Gy 处理种子形成的的幼苗个体较大，但120 Gy 处理种子未形成幼苗，仅有原球茎形成；然而，与菌株JL2、JL4 共生萌发条件下，60 Gy 处理种子形成的石斛幼苗个体较其他剂量小（图7）。与共生萌发培养条件相比，40～120 Gy 辐射处理种子在1/2MS培养基上萌发形成的幼苗生长较缓慢，叶片尚未展开（图7）。由此可见，经辐射处理的种子与菌株JL2、JL4共生萌发可促进其幼苗生长，获得更加健壮的幼苗。

图7 各剂量辐射处理的铁皮石斛种子在不同培养条件下形成的幼苗形态Fig.7 Seedlings morphology of D.candidum seeds treated with various radiation doses under different culture conditions

3 讨论

3.1 铁皮石斛种子半致死剂量

60Co-γ 辐射具有诱变突变频率高、加快新品种选育进程的潜力。适宜的辐射剂量有利于获得更多的有效突变，在一定范围内提高辐射剂量可增加诱变材料的突变率，但辐射剂量过高则会大大降低其成活率［23］。半致死剂量是保证植物材料存活并获得最大变异率的最佳剂量，其作为衡量适宜辐射剂量的重要标准在植物辐射育种中广泛应用［24］。石斛辐射诱变主要以原球茎［25］或组培苗［11］为材料，半致死剂量主要集中于30～70 Gy。本研究通过3 种不同培养条件对60Co-γ 辐射处理铁皮石斛种子进行萌发试验，发现种子半致死剂量为62～69 Gy，与已报道的辐射铁皮石斛原球茎的半致死剂量67.23 Gy 接近［26］，原因可能与诱变所用的种子材料处于成熟未休眠状态有关，为辐射铁皮石斛种子的剂量范围选用提供了参考。

3.2 60Co-γ辐射对铁皮石斛成苗率的影响

不同剂量的电离辐射会对植物的生长和发育产生不同的影响，如低剂量电离辐射对生长激素、细胞分裂素的合成和植物生长有刺激作用，而高剂量辐射对植物营养生长有抑制作用［27-28］。本研究发现，20 Gy处理对不同培养条件下石斛种子萌发、成苗均具有促进作用，这与Dehgahi 等［25］发现低剂量γ 射线可微弱促进D.Sonia28 原球茎生长的结果相一致。然而随辐射剂量的增加，各培养条件下辐射处理种子的成苗率逐渐降低，表明更高剂量的60Co-γ辐射会抑制幼苗形成，推测其原因在于高剂量辐射使种子受到较大伤害，种子活性下降，且萌发后自身恢复生长的能力大大减弱［29］。

3.3 菌根真菌对铁皮石斛辐射种子萌发和成苗的影响

在诱变育种中，通过调整培养条件提高突变细胞的竞争力，可获得稳定突变株［30］。卢敏［31］发现有益真菌的侵染可增强石斛组培苗的耐热性，提高其半致死温度。本研究探讨了胶膜菌属菌根真菌在铁皮石斛辐射种子萌发中的作用，发现与菌株JL2 共生萌发的辐射种子半致死剂量（69 Gy）较1/2MS 培养基对照组提高了7 Gy；另一方面，经高剂量（＞60 Gy）处理的种子与菌株JL2、JL4 共生萌发后可获得更多的诱变幼苗，表明菌株JL2 和JL4 对辐射处理后种子的生长具有一定的恢复作用。这与其他研究者关于内生真菌和丛枝菌根真菌通过侵染植物形成共生体以增强宿主在逆境条件下生存能力的报道相一致［32］。同时也表明，今后可通过与适宜真菌菌株共生培养，来提高铁皮石斛诱变材料在后期生长中的恢复能力和成活率。

4 结论

共生与非共生培养下，铁皮石斛种子萌发率随辐射剂量的增加呈下降趋势，较高剂量对幼苗形成有抑制作用，20 Gy 处理可促进铁皮石斛种子快速成苗，为缩短育种周期、快速扩繁提供技术参考。菌株JL2 和JL4 可在一定程度上提高铁皮石斛种子的辐射耐受能力，恢复辐射处理种子的生长分化能力。高剂量（90、120 Gy）辐射的种子与JL4 共生萌发可获得表型变化更明显的幼苗。兰科植物种子细小且数量多，因此为获得表型变化明显的突变株，可适当提高辐射剂量，并对辐射种子进行菌根真菌共生萌发培养。