刘英琦，施 喆，孙树刚#，周丽媛，杨 勇，王晓辉(.河北工程大学附属医院普外科，河北 邯郸056000； .河北工程大学附属医院妇科，河北 邯郸 056000)

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，主要包括肝细胞肝癌、胆管癌、肝母细胞瘤以及其他罕见类型的肝癌，其中肝细胞肝癌是原发性肝癌最常见的类型，据统计，肝癌在全球肿瘤相关性死亡中居第2位[1]。澳洲茄碱提取自中药龙葵，研究结果发现，澳洲茄碱具有广泛抗肿瘤作用，如膀胱癌、胆管癌以及肺癌等[2-4]。Liu等[5]的研究结果表明，澳洲茄碱可在肝癌中发挥抗肿瘤作用。丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/胞外信号调节激酶(ERK)信号通路主要参与调控细胞分化和凋亡，已有研究结果表明，该信号通路在肝癌中活化，ERK特异性抑制剂可减弱肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力[6]。因此，本研究以肝癌HepG2细胞为研究对象，探讨澳洲茄碱是否能通过调节MAPK/ERK信号通路抑制肝癌细胞的恶性生物行为学。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人肝癌细胞株HepG2购自美国ATCC公司。

1.2 仪器

SpectraMax iD5型多功能酶标仪(美国MD公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；CKX53型倒置显微镜(日本Olympus公司)；OPTIMA XPN型低温超速离心机(美国Beckman Coulter公司)；311型二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)。

1.3 试剂

澳洲茄碱(纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0620)；四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒(美国Sigma公司，批号：M2003-1G)；超敏型BCA法蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司，批号：P0012S)；胎牛血清和DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：6140079和12634010)；Matrigel基质胶(美国BD公司，批号：356234)；MAPK/ERK信号通路激活剂异丙肾上腺素(ISO，美国MCE公司，批号：HY-12028)；兔抗人磷酸化丝裂原激活的蛋白激酶激酶(p-MEK)、丝裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)和ERK抗体(美国Abcam公司，批号：ab278716、ab195037、ab192591和ab32537)。

1.4 细胞培养

HepG2细胞常规培养，每日在显微镜下观察，待细胞密度>80%时，胰蛋白酶消化传代，第4代对数生长期细胞用于实验。

1.5 MTT法测定澳洲茄碱对细胞存活率的影响

对数生长期细胞用DMEM培养基制成单细胞悬液，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板，细胞贴壁生长后，采用不同浓度澳洲茄碱处理(0、10、20、30、40和50 μmol/L)，置于培养箱中培养24 h，取出培养板，加MTT溶液20 μL，培养箱中培养4 h，加二甲基亚砜100 μL，振荡15 min，测定490 nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞存活率(%)=药物处理组A值/对照组A值×100%。取浓度为50 μmol/L的澳洲茄碱用于后续实验。

1.6 MTT法测定各药物对细胞存活率的影响

对数生长期细胞用DMEM培养基制成单细胞悬液，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板，细胞贴壁生长后，随机分为对照组、澳洲茄碱组、激动剂组以及激动剂+澳洲茄碱组，每组设置3个复孔，澳洲茄碱组细胞用50 μmol/L澳洲茄碱处理24 h，激动剂组细胞用ISO处理24 h，激动剂+澳洲茄碱组细胞用激动剂处理24 h后，50 μmol/L澳洲茄碱处理24 h。参照“1.5”项下方法测定细胞存活率。

1.7 划痕实验检测细胞迁移能力

按照“1.6”项下方法进行实验分组，各药物处理24 h后，将细胞制成5×103的细胞悬液，接种于6孔板，待细胞贴壁生长后，使用100 μL无菌枪头垂直培养板底部均匀划线，以磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞碎片清洗掉，加入新的培养基置于培养箱中培养，24 h后显微镜下拍照，计算划痕愈合率，划痕愈合率(%)=(0 h细胞划痕距离-24 h细胞划痕距离)/0 h细胞划痕距离。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力

按照“1.6”项下方法进行实验分组，各药物处理24 h后，将细胞制成5×103的细胞悬液。将150 μL细胞悬液接种于铺有Matrigel基质胶的上室中，下室则加入含10%胎牛血清的培养基600 μL，将小室置于培养箱中培养24 h，湿棉签将未侵袭细胞擦去，多聚甲醛固定小室20 min，结晶紫染色15 min，显微镜下观察并计数穿膜细胞数，随机取3～5个视野拍照。

1.9 蛋白质印迹法检测细胞中各蛋白表达

按照“1.6”项下方法进行实验分组，各药物处理24 h后，预冷PBS清洗3次，加入RIPA裂解，离心取上清液，采用蛋白定量试剂盒(BCA法)测定蛋白浓度，煮沸使蛋白质变性。进行凝胶电泳，浓缩胶每孔加入蛋白样品20 μL，设置电泳仪参数为120 V、2 h。电泳结束后，0.3 A恒流湿转2 h，将蛋白湿转至聚偏二氟乙烯膜上。Tris盐缓冲液(TBS)加入Tween-20制成的等渗缓冲盐溶液(TBST)洗膜，室温(25 ℃)封闭1 h，p-ERK、p-MEK、ERK、MEK和GAPDH抗体(1∶ 1 000)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶ 5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，超敏化学发光液显色，Image J分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参灰度值。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度澳洲茄碱对细胞存活率的影响

与0 μmol/L澳洲茄碱比较，10、20、30、40及50 μmol/L澳洲茄碱均可降低细胞存活率，差异有统计学意义(P<0.05)，且具浓度依赖性，见图1。

与0 μmol/L澳洲茄碱组相比，aP<0.05；与10 μmol/L澳洲茄碱组相比，bP<0.05；与20 μmol/L澳洲茄碱组相比，cP<0.05；与30 μmol/L澳洲茄碱组相比，dP<0.05；与40 μmol/L澳洲茄碱组相比，eP<0.05vs. 0 μmol/L solanine group, aP<0.05; vs. 10 μmol/L solanine group, bP<0.05; vs. 20 μmol/L solanine group, cP<0.05; vs. 30 μmol/L solanine group, dP<0.05; vs. 40 μmol/L solanine group, eP<0.05图1 不同浓度澳洲茄碱对细胞存活率的影响Fig 1 Effects of different concentrations of solanine

2.2 不同药物对细胞存活率的影响

四组细胞存活率比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，澳洲茄碱组细胞存活率降低(P<0.05)；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组细胞存活率升高(P<0.05)；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组细胞存活率降低(P<0.05)，差异均有统计学意义。对照组与激活剂组细胞存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

与对照组相比，aP<0.05；与澳洲茄碱组相比，bP<0.05；与激活剂组相比，cP<0.05Note: vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05图2 不同药物对细胞存活率的影响Fig 2 Effects of different drugs on cell viability

2.3 不同药物对细胞划痕愈合率的影响

四组划痕愈合率比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，澳洲茄碱组划痕愈合率降低，激活剂组划痕愈合率升高(P<0.05)；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组划痕愈合率升高(P<0.05)；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组划痕愈合率降低(P<0.05)，差异均有统计学意义，见图3。

与对照组相比，aP<0.05；与澳洲茄碱组相比，bP<0.05；与激活剂组相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05图3 划痕实验检测细胞迁移能力Fig 3 Migration ability of cells detected by scratch test n=3)

2.4 不同药物对细胞侵袭能力的影响

四组侵袭细胞数比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，澳洲茄碱组侵袭细胞数减少，激活剂组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组侵袭细胞数减少(P<0.05)，差异均有统计学意义，见图4。

与对照组相比，aP<0.05；与澳洲茄碱组相比，bP<0.05；与激活剂组相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05图4 结晶紫染色检测细胞侵袭能力Fig 4 Cell invasion ability detected by crystal violet staining (×200, n=3)

2.5 不同药物对细胞中各蛋白表达的影响

四组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量比较，组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，澳洲茄碱组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量降低，激活剂组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量降低(P<0.05)，差异均有统计学意义。ERK和MEK蛋白相对表达量各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图5。

与对照组相比，aP<0.05；与澳洲茄碱组相比，bP<0.05；与激活剂组相比，cP<0.05vs. the control group, aP<0.05; vs. the solanine group, bP<0.05; vs. the activator group, cP<0.05图5 蛋白质印迹法检测细胞中p-ERK、ERK、p-MEK和MEK蛋白表达情况Fig 5 Protein expressions of p-ERK, ERK, p-MEK and MEK in cells detected by Western blotting n=3)

3 讨论

肝癌早期不易发现，且诊断困难，肝癌细胞对放化疗不敏感，临床上常采用手术治疗，但术后极易复发，且5年生存率仅约10%，因此，探索肝癌发生机制以及寻找有效的治疗药物对临床治疗肝癌具有重大而深远的意义[7]。澳洲茄碱是糖苷生物碱。Zhang等[8]的研究结果发现，澳洲茄碱可通过上调微小RNA(miR)-486-5p表达，抑制胃癌细胞生长，诱导胃癌细胞凋亡，增强胃癌细胞对化疗药的敏感性。Wang等[9]的研究结果发现，澳洲茄碱通过抑制炎症信号通路，可抑制胶质瘤生长。已有研究结果表明，澳洲茄碱可诱导HepG2和Hep3b肝癌细胞凋亡[10]。但其具体机制尚不清楚。此外，Jin等[11]的研究结果发现，澳洲茄碱通过谷胱甘肽过氧化物酶4诱导的谷胱甘肽氧化还原系统的破坏，促进肝癌细胞铁死亡，从而发挥抗肝癌作用。本研究旨在探讨澳洲茄碱对肝癌细胞的抑制作用及其机制。

本研究采用不同浓度澳洲茄碱处理肝癌细胞，结果显示，与0 μmol/L澳洲茄碱比较，不同浓度澳洲茄碱均可降低细胞存活率，表明澳洲茄碱具有抗肝癌作用。ERK/MAPK信号通路参与多种肿瘤细胞恶性增殖[12-13]。研究结果发现，miR-452-5p通过激活ERK/MAPK正反馈环路促进结肠癌进展[14]。肺癌A549细胞中ERK/MAPK信号通路活化，抑制p-ERK1/2表达可减弱A549细胞的侵袭迁移能力[15]。He等[16]的研究结果发现，缺氧诱导的长链非编码RNA NPSR1-AS1通过使ERK1/2发生磷酸化，促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，NPSR1-AS1沉默则抑制MAPK/ERK信号通路，发挥抗肝癌作用。Wang等[17]的研究结果表明，长链非编码RNA LINC01503通过激活MAPK/ERK信号通路促进肝癌细胞恶性生物行为学。本研究为了进一步探索澳洲茄碱是否通过ERK/MAPK信号通路发挥抗肝癌作用，采用ERK/MAPK信号通路激活剂ISO激活该信号通路后给予澳洲茄碱处理。结果显示，与对照组比较，激活剂组划痕愈合率升高，侵袭细胞数增多；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组细胞存活率和划痕愈合率均降低，侵袭细胞数减少；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组细胞存活率和划痕愈合率均升高，侵袭细胞数增多。表明ERK/MAPK信号通路激活增强肝癌细胞增殖活性、迁移和侵袭能力。

MAPK信号通路参与多种生理病理过程，包括细胞增殖、分化和凋亡[18]。ERK是MAPK三条主要信号转导通路之一，受上游特异性刺激分子MEK1/2双磷酸化激活，活化后以二聚体形式存在，并从细胞质转位至细胞核，通过调控一系列转录因子，引起细胞增殖分化[19]。Xie等[20]的研究结果表明，mascRNA激活ERK/MAPK信号通路，调节转移相关基因，促进肝癌细胞侵袭表型。本研究通过蛋白质印迹法检测ERK/MAPK信号通路中的关键蛋白ERK和MEK，结果显示，与对照组比较，激活剂组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量升高；与激活剂组比较，激活剂+澳洲茄碱组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量降低；与澳洲茄碱组比较，激活剂+澳洲茄碱组p-ERK和p-MEK蛋白相对表达量升高。表明澳洲茄碱可抑制ERK/MAPK信号通路激活。

综上所述，澳洲茄碱可抑制肝癌细胞增殖活性，降低恶性肿瘤细胞恶性生物学行为，其可能是通过调节ERK/MAPK信号通路发挥作用，可为临床治疗肝癌提供理论依据。