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基于网络药理学及体外实验探究黄连阿胶汤治疗抑郁症的机制Δ

2023-03-21丁成成陈伟航彭甜甜张亚丽王雅蕾张华伟李海燕张佳妮刘肇恒北京中医药大学中医学院北京0009北京中医药大学生命科学学院北京0009北京中医药大学针灸推拿学院北京0009

中国医院用药评价与分析 2023年2期
关键词:阿胶槲皮素黄连

程 硕,谭 琰,丁成成,陈伟航,彭甜甜,张亚丽,王雅蕾,张华伟,李海燕,张佳妮,刘肇恒,王 旭,华 茜#(.北京中医药大学中医学院,北京 0009; .北京中医药大学生命科学学院,北京0009; .北京中医药大学针灸推拿学院,北京 0009)

黄连阿胶汤出自《伤寒论》,为安神剂-交通心肾剂,具有心肾交合、水升火将、滋阴泄火的功效,可用于抑郁症的治疗。网络药理学通过建立靶点、疾病、药物成分之间的相互作用关系图,从整体性和系统性2个方面认识疾病的本质,这与中药的整体观、辨证论治原则相一致。本研究基于网络药理学理论,对黄连阿胶汤治疗抑郁症的作用机制进行探讨,然后基于PC12细胞进行验证。

1 资料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 黄连阿胶汤有效成分及靶点获取:黄连阿胶汤的主要成分为黄连、黄芩、芍药、阿胶和鸡子黄。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、中药综合数据库、中药与化学成分数据库对5种药物进行有效成分及靶点的检索,将口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为筛选条件对其进行筛选,基于Uniprot数据库获取靶点官方基因名。

1.1.2 抑郁症相关靶点的获取:以“Depression”为关键词输入至人类孟德尔遗传综合数据库、DrugBank、GeneCards、治疗靶点数据库及Pharmgkb等数据库中获取相关靶点,GeneCards数据库获得的靶点以相关性评分≥10分作为筛选条件[1]。将黄连阿胶汤的靶点与抑郁症的靶点输入Venn平台中,获取交集靶点。

1.1.3 “药物-成分-靶点”网络图的构建:将黄连阿胶汤中的有效成分、作用靶点输入Cytoscape 3.7.2软件中,基于Network Analyzer功能,构建药物成分与靶点之间的网络图。

1.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建及核心靶点的筛选:将交集靶点输入平台STRING中,物种设定为“Homo sapiens”,最低互动得分设置为0.4,得到PPI图。利用软件Cytoscape 3.7.2对结果进行分析,以Average Shortest Path Length、Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Degree中位数作为筛选条件筛选核心靶点[2]。通过GEO数据库中GSE12654与GSE76826芯片分析核心靶点在抑郁症患者体内的表达情况。

1.1.5 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析:将交集靶点输入到DAVID平台中,物种设置为“Human”,进行GO及KEGG富集分析。

1.1.6 分子对接:基于软件AutoDockTools 1.5.6,对前10个有效成分和前10个核心靶点进行分子对接。基于PyMol软件获取对接模型图。

1.2 体外实验

1.2.1 仪器:QuantStudioTM3型荧光定量PCR仪(美国Agilent公司);SeriesⅡ WJ型细胞培养箱(美国Thermofisher公司);Allegra V-15R型离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.2.2 药品与试剂:黄连阿胶汤药材购自北京同仁堂有限公司,其中黄连12 g(批号:20220905),黄芩6 g(批号:22060401),芍药6 g(批号:22012402),阿胶9 g(批号:22031402),鸡子黄2枚。将药物用水浸泡30 min,然后煎煮1 h进行过滤,药渣加水继续煎煮30 min,进行过滤,然后合并滤液进行浓缩,加入鸡子黄,将药液浓缩至2 g/mL。多皮质酮(CORT,HPLC≥98%)、槲皮素(HPLC≥98%)、黄芩素(HPLC≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司。RPMI-1640培养基(#R8758)购自美国Sigma公司。CCK8试剂盒(#HY-K0301)购自美国MedChemExpress公司。

1.2.3 细胞培养:将PC12细胞置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养24 h,培养基为RPMI-1640培养基,其中添加10%热灭活的胎牛血清、5%马血清和1%的青霉素/链霉素。

1.2.4 分组与给药:将细胞分为空白组、模型组、槲皮素组以及黄芩素组。模型组、槲皮素组以及黄芩素组加入终浓度为200 μmol/L的CORT培养基溶液,空白组加入等体积细胞培养基。各组培养3 h后,槲皮素组和黄芩素组分别加入60 μmol/L的槲皮素和80 μmol/L的黄芩素,继续培养12 h后进行后续实验。

1.2.5 细胞活性测量:CCK8试剂盒用于测试细胞的活性。将细胞以5×104个/孔的密度种植于96孔板中,培养24 h,然后每孔添加CCK8溶液10 μL,继续培养1 h,测定其活性。

1.2.6 实时定量聚合酶链反应:将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)进行清洗,加入裂解液,离心后获得RNA沉淀,测定RNA的浓度与完整性,然后将RNA反转录成cDNA,以便进行扩增。实验中内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

2 结果

2.1 网络药理学

2.1.1 黄连阿胶汤有效成分的筛选:通过检索及筛选,共得到有效成分73种,其中黄连12种,黄芩36种,白芍8种,鸡子黄5种,阿胶16种,其中谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)为白芍与黄芩的共有成分,表小檗碱(epiberberine)、黄连碱(coptisine)为黄连与黄芩的共有成分。共得到靶点577个。

2.1.2 疾病靶点的筛选:对数据库进行筛选获得抑郁症靶点3 157个,黄连阿胶汤与抑郁症的交集靶点283个,见图1(A)。

A.药物-疾病靶点交集;B.成分-疾病靶点图;C.PPI图;D.核心靶蛋白相互作用图;E.核心靶点临床表达差异A. drug-disease target intersection; B. component-disease target; C. PIP; D. interaction of core target protein; E. different clinical expression of core targets图1 黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点筛选Fig 1 Screening of core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.3 “药物-成分-靶点”网络图构建:“药物-成分-靶点”网络图共有361个节点,1 077条边,形状越大表示连接度越高;槲皮素及黄芩素连接的靶点最多,见图1(B)。

2.1.4 PPI网络图的构建及核心靶点的筛选:PPI网络共有280个节点,6 181条边,见图1(C)。对PPI图进行4次筛选得到核心靶点5个,见图1(D),分别为白细胞介素(IL)1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和信号转导及转录激活因子3(STAT3),主要涉及炎症因子、功能生长因子等。通过GEO数据库对核心靶点的表达进行分析,见图1(E),核心靶点的表达均具有显著性差异。

2.1.5 GO和KEGG富集分析:GO功能富集分析主要涉及缺氧反应、突触后膜和质膜等。KEGG通路富集分析主要涉及缺氧诱导因子(HIF)1、TNF和环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等,见图2(A—B)。通路之间并非相互独立,不同通路之间拥有共同靶点,见图2(C)。图2(D)为HIF-1信号通路示意图,涉及上游信号IL-6、表皮生长因子(EGF)以及下游信号VEGFA、一氧化氮合酶(NOS3)等。

A.GO富集分析柱状图;B.KEGG富集分析气泡图;C.靶点-通路图;D.HIF-1信号通路A. histogram of GO enrichment analysis; B. bubble plot of KEGG enrichment analysis; C. target-pathway network diagram; D. HIF-1 signal pathway图2 黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点分析Fig 2 Analysis on core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.6 分子对接结果:共得到100组配体-受体结果,见图3(A)。所有的结合能均<-5 kJ/mol,66组结合能<-21 kJ/mol,占66%。此对接结果可以为今后药物的筛选提供支撑。

A.分子对接结合能热图(单位:kJ/mol);B.分子对接示意图(a.N-反式-阿魏酰基酪胺与VEGFA;b.β-谷甾醇与INS;c.豆甾醇与SRC)A. binding energy heatmap for molecular docking (Unit: kJ/mol); B. schematic diagram of molecular docking(a. moupinamide and TNF; b. beta-sitosterol and INS; c. stigmasterol and SRC)图3 小分子配体与大分子受体的分子对接Fig 3 Docking of small molecule ligands to macromolecular receptors

2.2 体外实验

2.2.1 皮质酮、黄连阿胶汤对细胞活性的影响:本研究设置4种不同浓度的皮质酮对细胞进行刺激,如图4(A)所示,随着皮质酮浓度的升高,细胞活性逐渐降低,当皮质酮浓度为200 μmol/L时,细胞活性为63%,因此本研究选择该浓度进行后续的实验。由图4(B—C)可知,当槲皮素及黄芩素的浓度分别低于60 μmol/L和80 μmol/L时对细胞活性无影响,本研究选择该浓度进行后续实验。

A.CORT;B.槲皮素;C.黄芩素;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001A. CORT; B. quercetin; C. baicalein; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001图4 不同单体对细胞活性的影响Fig 4 Effects of monomers on cell viability

2.2.2 黄连阿胶汤对PC12细胞活性及核心靶点表达的影响:与CORT组相比,槲皮素组和黄芩素组细胞活性均有所改善,差异均有统计学意义(P<0.05),说明槲皮素及黄芩素能够有效改善皮质酮对PC12细胞的损伤,见图5(A)。与对照组相比,CORT组可使炎症因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA和细胞因子STAT3 mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而槲皮素、黄芩素能够逆转这种趋势,见图5(B—D)。

A.槲皮素及黄芩素对细胞的活性影响;B—D.槲皮素及黄芩素对IL-1β、IL-6及STAT3表达的影响A. effects of quercetin and baicalein on activity of model cells; B-D. effects of quercetin and baicalein on expression of IL-1β, IL-6 and STAT3图5 槲皮素和黄芩素对细胞活性及靶点表达的影响Fig 5 Effects of quercetin and baicalein on cell activity and target expression

3 讨论

3.1 黄连阿胶汤治疗抑郁症的理论基础

抑郁症属于中医学“郁症”“脏燥”和“百合病”等范畴,其病因主要为气机郁滞、气血阴阳失调等,主要表现为肝肾阴亏、阴虚内热,导致神明失养,产生焦虑及抑郁的精神症状。因此,国医大师阮士怡认为可以通过“滋阴补肾”对抑郁症进行治疗[3-4]。黄连阿胶汤中,味苦的黄连与黄芩能够泄心火,使心气下交于肾,达到除阳目的[5];其他3味药白芍、阿胶和鸡子黄能够滋肾阴,使肾水上济于心,达到补阴的目的;所有药物合用,心肾交合,水升火将,滋阴泻火,正与抑郁症的病因相克,故在临床中黄连阿胶汤治疗抑郁症取得了良好的效果。

3.2 黄连阿胶汤治疗抑郁症的成分分析

由成分-靶点通路图可知,槲皮素及黄芩素可能在黄连阿胶汤治疗抑郁症中发挥重要作用。槲皮素作为黄连的主要成分之一,具有抗氧化、抗炎和神经保护等作用。有研究结果表明,槲皮素可以改善模型小鼠的抑郁样行为,提高海马区脑因子1、脑源性神经营养因子(BDNF)等表达水平,增强神经细胞的可塑性[6]。Mehta等[7]研究了槲皮素对抑郁模型小鼠大脑内氧化应激及神经炎症的影响,结果表明,槲皮素可以显著降低海马区氧化应激及神经炎症,减轻抑郁症状。

黄芩素具有抗氧化应激、抗炎和促进神经保护因子表达等多种药理作用,对神经系统疾病具有良好的预防及治疗作用[8-9]。Xiong等[10]研究了黄芩素对抑郁症动物的治疗作用,结果发现通过注射黄芩素,可以显著降低小鼠强迫游泳实验与悬尾试验的不动时间,逆转海马细胞外BDNF表达水平的降低,加强神经可塑性。

3.3 黄连阿胶汤治疗抑郁症的靶点分析

由PPI图可知,黄连阿胶汤治疗抑郁症的核心靶点主要包括IL-1β、IL-6、STAT3、蛋白激酶B(Akt)1、TNF和VEGFA。其中IL-1β、IL-6和TNF属于炎症因子,有研究结果表明,在抑郁症中,炎症反应会激活HPA轴,HPA轴的刺激会导致促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放[11]。Köhler等[12]对抑郁症患者及健康患者的细胞因子及趋化因子进行统计回顾及Meta分析,结果表明,与健康者相比,抑郁症患者体内IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著增加,说明炎症因子与抑郁症密切相关。

Akt1作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路下游的产物,与抑郁症密切相关[13]。Akt1以性别特异性的方式影响焦虑样行为,Akt1KO雄性小鼠增加了焦虑样行为[14]。PIK3CA-Akt1信号通路的激活在抑郁的嗅球切除大鼠模型中发挥抗抑郁样作用[15]。有研究结果表明,Akt可以调节抗抑郁药的功能,并有助于突触可塑性和神经传递的形成[9]。

STAT3在5-羟色胺能神经元系统中起着至关重要的作用,是控制情绪反应的分子介质[16]。STAT3的激活可以反映与神经功能相关的上游调节因子的作用,包括生长因子、激素和内源性大麻素等[17]。Kwon等[18]的研究结果发现,小胶质细胞中STAT3的功能障碍增强了巨噬细胞集落刺激因子对神经功能的作用,并通过抗抑郁途径上调BDNF表达,从而减轻了与抑郁相关的行为。

VEGFA是一种多功能生长因子[19]。有研究结果表明,VEGFA在神经保护和神经发生过程中发挥重要作用,并且可能参与某些神经系统疾病的发病机制[20]。Cui等[21]研究了抑郁模型大鼠海马组织和血清中VEGFA的表达变化,结果表明,其海马区及外周血的VEGFA mRNA和蛋白的表达均降低,揭示VEGFA的下调参与大鼠抑郁症的病理过程。

3.4 黄连阿胶汤治疗抑郁症的通路分析

由KEGG通路富集分析可知,黄连阿胶汤通过多条通路对抑郁症进行治疗,主要涉及HIF-1、TNF和cAMP信号通路。

HIF-1信号通路是维持氧平衡的重要通路,与其他通路交叉,形成细胞低氧应答的特异性和多样性。Li等[22]研究了FG-4592对抑郁的治疗作用,结果表明,FG-4592可以通过HIF-1介导的神经发生与突触可塑性改善大鼠的抑郁样行为。TNF是炎症的重要通路,其中TNF-α可以破坏血脑屏障,使得小鼠出现抑郁样行为[23-24]。Xu等[25-26]从小胶质细胞的激活与神经炎症2个方面研究了牛蒡子苷元(Arctigenin)对抑郁的治疗作用,结果表明,慢性不可预测轻度应激通过激活小胶质细胞TNF-α/TNF受体1(TNFR1)信号通路、增加核因子κB的磷酸化和核转位以及诱导炎症使得小鼠出现抑郁样行为,而Arctigenin可以有效逆转这种趋势并减少炎症引起的抑郁样行为。cAMP是研究最早、最为深入的抗抑郁信号转导通路。Fujita等[27]研究了抑郁症患者使用5-羟色胺再摄取抑制剂前后大脑中cAMP信号传导的变化,结果表明,未服药的患者表现出cAMP级联反应活性显著降低,2个月的5-羟色胺再摄取抑制剂治疗显著增加了cAMP活性。

通过以上分析,本研究推测黄连阿胶汤可能通过调节氧化应激、炎症因子和神经营养因子对抑郁症产生治疗作用,见图6。

图6 黄连阿胶汤治疗抑郁症的机制图Fig 6 Mechanism diagram of Huanglian Ejiao decoction in treating depression

综上所述,网络药理学和体外实验结果表明,黄连阿胶汤通过多成分、多靶点和多途径的协同作用来缓解抑郁症。本研究推测黄连阿胶汤可能通过HIF-1通路、TNF通路和cAMP通路,IL-1β、IL-6、TNF、Akt1和STAT3靶点调节氧平衡、炎症因子和神经营养因子,从而对抑郁症发挥治疗作用。本研究揭示了黄连阿胶汤治疗抑郁症的作用机制,为中医药的进一步应用提供了基础。

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