张慧，韩雪莹，赵婷，张暋

(郑州金域临床检验中心有限公司 分子病理，河南 郑州 450000)

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS) 是起源于造血干细胞异常增生的克隆性血液疾病[1]。该病的诊断、预后评估主要涉及细胞形态学、细胞遗传学和分子检测等方法[2]。细胞形态学和细胞遗传学作为传统的检测方法，存在一定的局限性，对于缺乏典型MDS疾病特征的病例，这些检测方法无法作为临床诊断的金标准，目前临床认为肿瘤的发病机制与基因突变相关[3-5]，分子病理的检测结果有助于肿瘤的精准治疗与分类，所以对MDS及疑似患者进行分子鉴别诊断是重要的检验方式[6-7]。本研究选取533例确诊或者疑似MDS标本进行分析，使用二代测序(next-generation sequencing，NGS)检测方法，分析MDS患者基因突变类型的分布情况，并且结合临床患者资料和核型检测结果分析MDS中的基因突变规律。

1 资料与方法

1.1 样本资料收集郑州金域临床检验中心2019年8月至2020年9月接受NGS方法检测MDS相关基因突变的533例患者的数据，每例样本检测22个(ASXL1、DNMT3A、U2AF1、TET2、TP53、RUNX1、SETBP1、SF3B1、EZH2、CBL、BCOR、SRSF2、ZRSR2、STAG2、IDH2、NF1、NRAS、JAK2、IDH1、ETV6、PHF6和KRAS)基因突变情况。分析MDS疾病相关基因突变的类型并绘制突变谱。结合患者年龄、性别及核型分析结果。533例患者年龄15～90岁，中位年龄65岁。基因突变阳性347例，其中男220例，女125例，性别不详2例。

1.2 DNA的提取和NGS的检测提取乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝血DNA，DNA总量达到1 000 ng。将DNA进行酶切打断，末端修复后加A尾和接头。经磁珠筛选后用乙醇进行纯化，制备文库。用设计好的MDS相关基因探针进行文库杂交，并对靶基因进行捕获上机(型号Illumina Nextseq 550)。数据分析时，需要先过滤掉良性突变位点，同义突变位点，并且查看测序质量过滤掉低频突变且质量不好造成假阳性的位点，其余位点根据分级证据进行临床意义分级，Ⅰ类突变位点具有强临床意义，Ⅱ类突变位点具有潜在临床意义，Ⅲ类突变位点临床意义未明，Ⅳ类突变位点临床意义良性或可能为良性。

1.3 FISH实验方法吸取2 mL抗凝血，2 200 r·min-1离心4 min，离心半径为160 mm，弃上清液，加8 mL氯化钾进行低渗处理；加8 mL固定液固定(蛋白变性硬化，染色体形态固定)；加固定液滴片，56 ℃烤30 min～2 h，观察细胞数；洗杂质，加探针，75 ℃ 5 min，37 ℃ 18 h杂交；洗掉未结合的探针，加5 μL 125 μg·L-1DAPI复染，最后通过显微镜计数。

1.4 统计学方法采用SPSS统计软件处理数据。计数资料以频数(n)和百分比(%)表示，采用χ2检验比较，如期望理论频数小于5则采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS 22个相关基因阳性检出情况选取与MDS相关的22个基因进行NSG检测，将检测到基因突变的结果称为阳性结果。发现533例MDS标本中阳性结果共计347例，总阳性率为65.1%。其余未检测到22种基因突变的结果称为阴性结果。如图1所示，在347例阳性结果中突变率最高的是ASXL1基因，阳性率高达38.6%，阳性率较高的DNMT3A、U2AF1、TET2、TP53基因的阳性率分别为20.4%、19.8%、18.1%、15.2%，KRAS基因阳性率最低，为1.7%。

2.2 MDS相关基因突变谱的分析将347例数据中的突变位点制作成基因突变谱，如图2所示，图中不同深浅的灰色代表不同的突变类型，其中Multi_Hit代表同1例样本同1个基因有2种及以上的突变形式。ASXL1基因的移码突变和无义突变较多，同时发生多个突变的样本也相对较多，这些突变常发生于13号外显子上。在移码突变中，G646fs(44.3%)和G645fs(40.8%)数量较多。在无义突变中，R693(26.6%)数量较多，点突变的数量较少。在134例ASXL1基因突变中只有7例(D656N、R625Q、G927R、G99R、R413W和I597N，其中R625Q出现了2例)为错义突变，这些位点都是临床意义未明的Ⅲ类位点，暂时无相关文献报道其与MDS的相关性。DNMT3A基因点突变的数量较多，频率最高的是R882(38.3%)，其次是R736(14.5%)和R635(7.9%)。U2AF1基因只有点突变：S34(76.2%)和Q157(20.4%)，其中有2例同时发生这2个点突变。TET2基因突变主要以点突变、无义突变、移码突变为主，且多个同1样本包含2个及以上的突变位点，其中包含2个突变位点的有17例，3个突变位点的有5例，4个突变位点的有1例。TP53基因突变以点突变居多，剪切位点突变较少，多个突变位点的样本中只有2个突变位点同时发生，其中出现频率较高的有R273、R248、R175。RUNX1基因突变点突变和移码突变较多，多个同1个样本出现多个突变位点，点突变中有一些Ⅱ类位点和Ⅲ类位点。SETBP1基因突变点突变居多，出现频率最高的是D868(47.2%)，其次是G870(22.8%)。SF3B1基因突变点突变居多，其中K700有19例(52.1%)，K666有9例(24.8%)，K700_K701del有2例(4.9%)。EZH2基因点突变居多，无义突变、移码突变和剪切位点突变都是Ⅰ类突变，点突变大部分是Ⅲ类突变，有2个点(R690C和V626M)是Ⅱ类位点，有零星文献报道这2个位点可能有临床意义。CBL基因点突变居多，有少量无义突变，点突变中C404有3例(11.1%)，R420有6例(22.4%)，Y371有3例(10.6%)。BCOR基因有多种突变类型，有个别突变出现了2次，其余突变都只出现了1次，有1例样本同时出现了5个突变位点，另外还有6例(22.4%)同时出现了2个突变位点。SRSF2基因的21例阳性样本中只有2种突变，P95有17例(80.8%)，P95-R102del有4例(19.2%)。ZRSR2和STAG2基因有多种突变类型，ZRSR2基因中较多的是剪切位点突变。IDH2基因有1例R172-H173delinsSA突变，其余R140Q居多，有11例(60.6%)。NF1基因有多种突变形式，无规律。NRAS基因点突变居多，G12有12例(65.8%)，G13有3例(16.2%)。JAK2基因的V617F突变位点最多。IDH1基因的R132最多，有9例(60.2%)。ETV6和PHF6基因有多种突变类型，PHF6基因中R274Q是1个Ⅱ类位点，出现了2次。KRAS基因只有点突变，包括G12、G13、T58、A59 共4个点。

2.3 MDS相关基因突变与患者年龄的相关性分析将347阳性结果的患者按照年龄分为<60岁组和≥60岁组，其中有5例年龄不详。如表1结果所示，将套餐内的22个基因按照年龄分组进行统计分析，两组DNMT3A、U2AF1、TET2、SETBP1、SF3B1、CBL和SRSF2基因阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明这些基因突变与患者年龄相关，其中DNMT3A、TET2、SF3B1、CBL和SRSF2基因突变多见于60岁以上患者中，而U2AF1和SETBP1基因突变常见于60岁以下患者中。两组其他基因阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 MDS相关基因突变与患者性别的相关性分析将347阳性结果的患者按照性别分组，其中2例性别不详。如表1结果所示，将套餐内的22个基因按照性别分组进行统计分析，结果显示，不同性别ASXL1、U2AF1、SRSF2、ZRSR2基因阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且男性这4个基因的阳性率高于女性。不同性别其他基因突变阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同年龄和性别患者的MDS相关基因突变阳性率比较[n(%)]

表1(续)

2.5 NGS阳性患者中核型结果分析347例患者中，发生TP53基因突变的样本共51例，如图3所示，其中有40例患者进行了FISH MDS 4项的检测(5q-、+8、20q-、7q-)，且20例检测到了5q-，表明TP53基因突变常会伴有5号染色体缺失的现象。另SETBP1基因突变样本共38例，其中有31例同时进行了FISH检测，3例检测到了7q-，显示SETBP1基因突变偶尔伴有7号染色体的缺失。

2.6ASXL1基因与其他基因突变相关性分析347例NGS阳性结果中ASXL1基因的突变率最高，在对这些阳性结果进行统计的时候发现ASXL1基因常常伴随某些基因同时出现，选取与ASXL1基因同时出现率最高的5种基因，分别为U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1和TET2基因。如图4所示，ASXL1基因发生突变时，U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1基因阳性率明显高于ASXL1基因阴性时的阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明U2AF1、SETBP1、EZH2、RUNX1基因突变常伴随ASXL1基因突变，而TET2基因与之无相关性。

3 讨论

选取533例MDS相关基因(22个)突变检测结果，其中347例样本检测到这22个基因的阳性结果，通过分析整个基因突变谱，其中Ⅰ类突变位点为依据NCCN指南中明确显示的位点或者突变类型，这些位点有些对预后和用药有指导作用。Ⅱ类位点在MDS中无特别明确的临床意义或在其他疾病中有相关临床意义的研究。Ⅲ类突变表示无临床文章报道，临床意义未明[8]。有些位点突变频率接近50%或100%，提示良性杂合胚系突变的可能性很高，也有Ⅰ类Ⅱ类位点出现胚系突变，Ⅰ类胚系突变可能和致病相关[9]。频率远离50%或100%的Ⅲ类突变位点也常常出现，但临床意义未明，可能成为MDS潜在的诊断或预后的靶点，有待后续的研究证实，给MDS分子诊断提供了新的研究方向。

把NSG结果同患者年龄、性别结合起来分析，发现有些基因突变与性别、年龄具有相关性，说明不同年龄和性别的人群对某些基因可能存在易感性。FISH分析结果可以提示预后，例如TP53在5q-MDS中突变率为15%～20%，TP53突变是MDS预后不良的独立因素[10]，来那度胺为5q-综合征患者的首选药物，突变提示对来那度胺治疗无效或治疗后失效，另TP53突变提示在干细胞移植后总生存期较短。本文分析结果表明TP53基因突变常伴有5q-，占比达到了50%，符合相关文章的研究结果，而SETBP1是造血相关基因，在MDS中突变率低于5%，多伴7号染色体或者7q-[11]，提示疾病进展。本次分析结果7号染色体异常与SETBP1基因突变重合率并不高，但是二者结合分析有利于辅助MDS的诊断和治疗，提示疾病进展。

在MDS基因突变谱的分析结果中，阳性率最高的是ASXL1基因，其大部分突变都是移码突变，导致C末端截短，影响蛋白的结构和功能[12]。ASXL1变异常见于MDS中，常与U2AF1及TET2基因变异共存，伴有该变异的患者白血病转化率高[13]。通过分析发现ASXL1突变与U2AF1、SETBP1、EZH2和RUNX1基因突变有相关性，说明ASXL1基因突变常伴有这4个基因共突变。ASXL1编码表观调节因子在MDS中突变率为15%～25%，ASXL1基因突变是MDS预后不良的独立因素。其他 4个基因中U2AF1基因参与编码RNA剪接因子，在MDS突变率为8%～12%，与不良预后相关；EZH2基因在MDS中突变率为5%～10% ，是MDS和MDS/MPN预后不良的独立因素；RUNX1基因是造血过程中关键基因，其变异会导致多种恶性血液病，在MDS中突变率为10%～15%，也是MDS预后不良的独立因素，该突变在其他血液肿瘤中亦见报道。这3个基因突变都显示了不良预后，再伴随ASXL1基因突变，不良预后发生风险更高。

NGS技术在MDS的诊断和预后中发挥了重要的作用，可以辅助诊断分级和临床治疗方案的制定。目前在指南中，已有数个基因突变在MDS中有明确的临床意义，甚至已经具体到某1个位点，同1个基因的不同位点突变有不同的意义，例如SF3B1基因的Ⅰ级位点突变可用于MDS疾病的分型，而Ⅲ级位点是临床意义未明。这说明研究具体位点突变具有重要的临床意义，NGS技术以高通量的优点被熟知，不仅在临床检测中可测出基因突变的所有位点，协助临床治疗，而且在科研中，NGS技术为血液病的分子研究提供了技术支持。随着测序技术的不断成熟，MDS基因突变的临床意义理解和应用将不断更新。