梁婷，梁沁，周翠娟，卢静兰

(广西医科大学第八附属医院 贵港市人民医院，贵港 537100)

胚胎质量和内膜容受性是影响辅助生殖技术(ART)助孕成功的两个关键因素。近年来，随着促排卵方案的优化、受精方式的改进和胚胎培养及筛选技术的提高，胚胎质量已得到较为充分的保障。因此，改善子宫内膜容受性成为提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)临床妊娠率、降低胚胎反复种植失败的关键[1]。

输卵管积液是育龄期妇女常见的疾病，是慢性盆腔炎性疾病后遗症的主要表现。尽管IVF-ET最初就是主要针对输卵管因素性不孕症进行治疗，但令人费解的是，与其他不孕原因患者相比，重度输卵管积液不孕患者往往临床助孕结局较差[2]。一些回顾性研究表明，输卵管积液患者的胚胎着床率和妊娠率较低[3-4]，输卵管积液与IVF的不良结局之间存在明确的联系[4-5]。输卵管积液患者的自然流产率也有所增加[6-7]。另一方面，在IVF之前接受输卵管切除术的输卵管积液患者，临床妊娠率和活产率增加[8]。其他回顾性研究也报告了输卵管积液患者行输卵管切除术后的预后得到改善[4-5]。

输卵管积液对生育结局的损害不仅与输卵管积液的胚胎毒性有关，而且与其所致内膜炎性环境有密切联系。研究认为输卵管积液主要包含炎症性因子、免疫细胞和坏死组织，积液倒流引起宫腔积液，影响子宫内膜的形态[9]。炎症环境使内膜免疫微环境受到破坏，有可能会引起慢性子宫内膜炎(chronic endometritis，CE)，并损害子宫内膜容受性[10]。

对于输卵管积液的患者，准确评估其子宫内膜容受性是改善助孕结局的关键。然而，目前临床上评估子宫内膜容受性的方法较简单，仅从激素水平和超声影像学评估某一时间点的内膜状态，其准确性和可重复性均存疑，缺乏动态的、综合的内膜容受性监测手段。本文将综合超声学指标、子宫内膜容受性分子标志物，如同源框基因A10(homeobox gene A10，HOXA10)、整合素αvβ3等，连续、动态地评估输卵管积液患者的子宫内膜容受性，以期为输卵管积液导致不孕的患者提供治疗依据。

资料和方法

一、研究对象

以2020年7月至2022年6月在贵港市人民医院生殖中心助孕的不孕症患者作为招募对象。

输卵管积液组(积液组)纳入标准：(1)年龄20～40岁，卵巢储备功能正常；(2)因输卵管因素、男方因素等进行IVF/ICSI-ET或冻融胚胎移植(FET)；(3)子宫输卵管造影(HSG)提示至少一侧存在输卵管积液；(4)近3个月未使用抗生素；(5)近3个月未使用口服避孕药和雌孕激素类药物。无输卵管积液组(对照组)纳入标准除(3)外，其余与积液组相同，(3)改为HSG排除双侧输卵管积液。

排除标准：(1)存在严重心肺功能不全等全身性疾病，不能耐受宫腔镜手术或内膜活检和不能耐受妊娠；(2)卵巢功能不全或内分泌紊乱；(3)双方或一方染色体异常。两组排除标准相同。

经过招募，最终纳入符合标准的患者197例。其中，积液组(至少一侧输卵管积液)91例，对照组(无输卵管积液)106例。所有入组患者均签署知情同意书。本课题经贵港市人民医院伦理委员会的审批。

二、研究方法

1.记录患者基本资料：年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、宫腔操作史、基础激素水平(E2、FSH、LH)、抗苗勒管激素(AMH)水平等。

2.超声监测：入组患者胚胎移植前1～2个自然月经周期的早卵泡期、晚卵泡期、排卵期以及黄体期的子宫内膜厚度、子宫动脉搏动指数(PI)和阻力指数(RI)。

3.内膜活检：积液组和对照组分别有27人和31人自愿进行内膜活检。内膜活检于排卵后第7天(LH+7)进行，检查无禁忌证后，取截石位，消毒铺巾后，使用一次性S型宫腔组织吸引管(立可灵TY-C3.1/30-1S型，上海家宝)进行子宫内膜组织取样。活检组织置于中性福尔马林中固定。

4.免疫组化染色：对固定24 h的组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。用SP三步法检测子宫内膜容受性指标整合素αvβ3(16-0519-81，Invitrogen，美国；稀释1∶100)、HOXA10(sc-271428，Santa Cruz，美国；稀释1∶100)以及CE分子标志物CD138(ab128936，Abcam，美国；稀释1∶5 000)的表达。将切片60℃烤片2 h后，进行脱蜡和水化，放入柠檬酸钠缓冲液(C1032，北京索莱宝)中进行高压抗原修复10 min，自然冷却后用双氧水灭活内源性过氧化物15 min，山羊血清封闭20 min，随后加入一抗，置于4℃过夜。复温后加入相应二抗(PV-9001，北京中杉金桥)孵育30 min，DAB(ZLI-9018，北京中杉金桥)显色1 min，苏木素染核30 s，随后进行返蓝，脱水，风干，透明，封片后镜下观察。

CE的诊断以每高倍镜视野下出现大于5个CD138阳性的浆细胞作为标准。整合素αvβ3及HOXA10的相对表达量采用H-score方法对免疫组化结果进行评分：随机选择5个视野，分别对每个视野的阳性信号强度和阳性细胞数比例进行评分。阳性信号强度分为强、中、弱三类，分别记3、2、1分；阳性细胞数比例为视野中阳性细胞的数量占所有细胞数的比值，以百分数表示。单个视野H-score评分为信号强度的得分×阳性细胞百分数，计算5个视野的平均值为该切片的最终评分。

5.CE的治疗：对于确诊为CE的患者，每日口服多西环素100 mg，治疗14 d。治疗完成后的下一个周期再行内膜活检复查(方法同前)，评价治疗效果以及子宫内膜容受性变化。

三、统计学分析

结 果

一、入组患者基线资料

本研究共纳入197例病例，其中积液组(至少一侧输卵管积液)91例，对照组(无输卵管积液)106例。两组患者在年龄、不孕年限、BMI、宫腔操作史、基础性激素水平、AMH水平等方面均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者基线资料比较[(-±s)，n(%)]

二、两组患者不同时期内膜厚度/类型及内膜血流参数

两组患者间子宫内膜厚度在早卵泡期和晚卵泡期无统计学差异(P>0.05)，在排卵期和黄体期，积液组子宫内膜厚度均显著薄于对照组(P<0.001)(表2，图1)。两组患者的子宫内膜类型构成比在早卵泡期、晚卵泡期和黄体期均无统计学差异(P=0.468)；在排卵期，对照组有9.43%(10/106)的患者内膜未转化(仍为A型)，而积液组仍有21.98%(20/91)患者的内膜未转化，差异有统计学意义(P=0.017)(表2，图2)。两组间内膜血流参数比较，积液组的RI在排卵期和黄体期显著高于对照组(P<0.05)，而PI在各期差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者各时期内膜厚度、类型及内膜血流参数比较[(-±s)，n(%)]

与积液组比较，*P<0.001。图1 两组患者月经周期子宫内膜发育情况

排卵期两组患者A型内膜率比较，*P<0.05。图2 两组患者月经周期子宫内膜类型比较

三、两组患者HOXA10及整合素αvβ3评分

积液组和对照组分别有27名和31名患者进行内膜活检，活检时间为LH+7。通过免疫组化方法观察两组患者内膜组织中HOXA10及整合素αvβ3在细胞质中的表达情况(图3和图4)，并将结果进行H-score量化，发现积液组两个指标的H-score评分均显著低于对照组(P<0.001)(表3)。

A：积液组；B：对照组；右侧系相应左图(×100)方框区放大图像(×400)。图3 两组患者子宫内膜组织中的HOXA10表达(免疫组化染色)

A：积液组；B：对照组；右侧系相应左图(×100)方框区放大图像(×400)。图4 两组患者子宫内膜组织中的整合素αvβ3表达(免疫组化染色)

表3 两组患者子宫内膜组织HOXA10和整合素αvβ3免疫组化结果量化(-±s)

四、两组患者CE发病率

在进行内膜活检的患者中，积液组一共有13名患者存在CE，CE发生率为48.14%(13/27)。对照组一共有6名患者存在CE，发生率为19.35%(6/31)；积液组CE发生率显著升高(P=0.02)(表4)。

表4 内膜活检患者中CE发生率(%)

五、CE治疗前后HOXA10及整合素αvβ3评分比较

所有19例CE患者均进行了抗生素治疗，治疗后均再次进行了内膜活检。再次活检证实积液组仍有2名患者存在CE，对照组有1名患者存在CE，整体治愈率为84.21%(16/19)。与治疗前相比，所有患者治疗后的HOXA10表达量有升高趋势(图5)，但没有达到统计学差异(P>0.05)(表5)；整合素αvβ3的表达量在治疗后明显升高(图6)，且差异具有统计学意义(P<0.001)(表5)。

A：治疗前；B：治疗后；右侧系相应左图(×100)方框区放大图像(×400)。图5 CE患者治疗前后子宫内膜组织中的HOXA10表达(免疫组化染色)

A：治疗前；B：治疗后；右侧系相应左图(×100)方框区放大图像(×400)。图6 CE患者治疗前后子宫内膜组织中的整合素αvβ3表达(免疫组化染色)

表5 CE治疗前后内膜组织HOXA10和整合素αvβ3免疫组化结果量化(-±s)

讨 论

本研究中，我们通过检测月经周期各时期子宫内膜类型、厚度、内膜血流参数PI和RI，以及容受期子宫内膜容受性分子标志HOXA10和整合素αvβ3，探究了输卵管积液对子宫内膜容受性的影响。结果发现与无输卵管积液的患者相比，存在输卵管积液的患者子宫内膜受到一定程度的损害，表现为子宫内膜生长缓慢，RI增大，排卵期内膜转换延缓，CE发生率升高，以及子宫内膜容受性分子的表达下降。

目前，超声检查仍是临床上最常用于评估子宫内膜容受性的方法[11]。通过分子手段如基因芯片、免疫组化等方法评估子宫内膜容受性分子的表达多用于实验研究[12]。子宫内膜容受性微阵列(Endometrial receptivity array，ERA)是较为全面地评价容受性的方法，但由于该方法效果未明确且价格昂贵，在国内仍少有使用[13]。

超声检查一般以子宫内膜类型、子宫内膜厚度以及内膜血流参数PI、RI等指标对子宫内膜容受性进行评估。良好的子宫内膜表现为排卵期发生内膜转化，内膜厚度达到10 mm以上，PI、RI在正常范围内[14]。本研究中，我们发现从排卵期开始，积液组的子宫内膜厚度就低于对照组，一直持续到黄体期。积液组在排卵期仍有21.98%(20/91)的患者内膜未转化，显著高于对照组的9.43%(10/106)。血流动力学上，我们观察到积液组的RI在排卵期和黄体期高于对照组，但PI没有明显差异。吴洪波等[15]研究发现输卵管积液会降低患者HCG注射日A型血流及三线型内膜的比例，但对血流参数PI、RI及子宫内膜厚度无明显影响。产生这种差异的原因可能是我们与该研究的设计类型、纳入/排除标准等存在差异。且本研究选取了月经周期中具有代表性的4个不同时间点进行检测，从而可以动态地了解内膜容受性的变化。

HOXA10和整合素αvβ3是常用于评价子宫内膜容受性的指标。HOXA10是同源框基因家族的一员，该基因敲除后会导致子宫内膜蜕膜化障碍，引起不孕[16]。整合素αvβ3在子宫内膜上皮细胞以及胚胎的滋养层细胞中均有表达，在母胎识别和黏附过程中发挥关键作用[17]。我们的研究发现，HOXA10和整合素αvβ3在输卵管积液患者子宫内膜的表达均较无输卵管积液的对照组低，这一结果与李艳萍[18]的研究相似。此外，周云[19]研究发现，输卵管积液患者在接受硬化治疗后，子宫内膜组织中的血管内皮生长因子(VEGF)、整合素αvβ3、HOXA10等分子表达升高。这些结果表明，输卵管积液最终可能会通过损害子宫内膜容受性，导致不良妊娠结局，而对输卵管积液加以纠正可能改善妊娠结局。

输卵管积液对胚胎的毒性作用被认为是造成女性生育率下降的主要原因。但后来发现，在进行胚胎移植的患者中，存在输卵管积液的患者妊娠率仍较不存在输卵管积液的患者低，因此输卵管积液对内膜的损害作用也开始受到重视[20]。当输卵管积液反流至宫腔时，积液中的炎症因子、细胞因子、病原体可能会对子宫内膜产生损害作用。有研究发现，存在输卵管积液的患者CE检出率升高，表明积液对内膜造成了损害[10，21]。本研究中我们检测了一部分患者子宫内膜CD138的表达，发现积液组CE的检出率是48.14%(13/27)，显著高于对照组的19.35%(6/31)，这个结果与前述研究结果一致。此外，我们还发现，输卵管积液伴有CE的患者，CE治愈后HOXA10的表达没有显著变化，但整合素αvβ3的表达显著上调，提示CE的治疗可能在一定程度上改善患者的子宫内膜容受性。这也提示我们，CE的检测和治疗可能是输卵管因素不孕患者诊疗的一个重要部分。

本研究的优势在于，我们连续观察了输卵管积液患者一个完整月经周期的子宫内膜超声参数。月经是一个周而复始的过程，既往的研究往往只关注种植窗口期子宫内膜容受性的状态，连续的评估则可以发现子宫内膜在哪个时期就开始出现异常。本研究的不足在于样本量小，仍需要更多的临床数据加以支持；此外，本研究中没有继续随访患者后续的妊娠结局，无法将患者的超声学参数和免疫组化结果与妊娠结局相联系。

综上所述，本研究发现输卵管积液会增加子宫内膜血流阻力，使内膜生长和转化延缓。并且，输卵管积液降低子宫内膜容受性分子标志物HOXA10和整合素αvβ3的表达，增加CE发生风险；而CE的治疗可能在一定程度上改善子宫内膜容受性。