邢鹏，袁博，王娜，李澎涛，殷晨星，李克用，孟娜娜

(1.保定市妇幼保健院生殖医学科，保定 071000；2.河北大学附属医院儿科，保定 071000)

卵胞浆内单精子注射(ICSI)是治疗男性因素不育症最有效的方法[1]，其唯一的先决条件是每一枚成熟的卵母细胞中需要注射一条形态正常的活精子[2]。严重少弱畸精子症(severe oligo-astheno-teratozoospermia，sOAT)是指2次及以上规范的精液分析显示：0<精子浓度<1×106/ml[3]，前向运动精子(PR)百分率<1%或前向运动精子总数(total progressive motile sperm count，TPMSC)<100万[4]，精子正常形态百分率≤1%[5]。隐匿精子症(cryptozoospermia)属特殊类型，即常规镜检未发现精子，离心后精液标本中可发现精子。Palermo 等[6]最初声称，ICSI 成功率不受精子浓度、形态和活动性的影响。但是，此后越来越多的研究表明，注射一个完全不动的(并且可能是死的)精子会对ICSI的受精和临床结局产生负面影响[7-8]，且精子形态对ICSI的临床妊娠率有显著性的预测作用[9]。近年来，sOAT患者在经历了射精精子ICSI 失败后，使用睾丸精子重复 ICSI的研究逐渐增多[10-11]。但对于这些非无精子症男性的ICSI助孕治疗，睾丸精子的疗效是否优于射精精子仍然存在较大争论[12-13]，这也给男科临床医生向患者推荐最优的治疗方法带来了困扰。本研究选取因男性sOAT在保定市妇幼保健院生殖医学科行ICSI助孕的患者，分析采用射精精子和睾丸精子患者的实验室和临床指标差异，探讨睾丸取精能否改善sOAT患者的ICSI助孕结局。

资料与方法

一、研究对象和分组

本研究采用回顾性研究。选择2016年1月至2020年6月期间，在保定市妇幼保健院生殖医学科因男方sOAT在不同周期分别用射出精子和睾丸精子抽吸术(testicular sperm aspiration，TESA)行ICSI助孕的患者为研究对象。

纳入标准：(1)男方：0<精子浓度<1×106/ml或PR<1%或TPMSC<100万，精子正常形态百分率≤1%；(2)女方年龄≤38岁且抗苗勒管激素(AMH)>1 ng/ml；(3)女方成熟卵(MⅡ)获卵数≥7枚。

排除标准：(1)逆行射精；(2)完全圆头精子症、无头精子症、大头精子症及精子鞭毛多发形态异常[14]；(3)夫妻任何一方存在染色体核型异常；(4)女方卵巢低反应[15]；(5)女方子宫内膜异位症及其他卵巢囊性肿物者。

根据纳入和排除标准，最终58对夫妇符合研究标准，共接受了98个ICSI周期治疗。按照获取精子的方式不同，将患者分为2组：射出精子ICSI组(E-ICSI组，56个周期)和睾丸精子ICSI组(T-ICSI组，42个周期)。本研究获得保定市妇幼保健院伦理委员会批准。

二、ICSI治疗过程

1.控制性卵巢刺激(COS)及卵母细胞收集：采用卵泡期长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)(亮丙瑞林，上海丽珠)方案或促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant)(西曲瑞克，默克雪兰诺，法国)方案进行COS。当至少1枚优势卵泡直径≥20 mm或3枚卵泡直径≥18 mm时，行人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)扳机。36 h后行阴道超声下取卵(OPU)，取卵术后常规给予黄体支持。

2.精子收集及制备：采用2种取精方式收集精子。(1)射出精子：患者禁欲3～7 d，OPU当日，采用手淫的方式留取精液。(2)睾丸取精，分两种情况：①OPU日自然排精后，未找到可用的精子，选择TESA方式抽取曲细精管；②经历过射出精子-ICSI失败的患者，本周期OPU日直接选择TESA。留取少量曲细精管于G-Mops液中，立即送胚胎实验室，1 ml注射器针头撕碎后镜检，可见形态正常的活动精子，取精结束。

采用mini-SpermGrad单层梯度法处理，即用45%的SpermGrad 0.2～0.3 ml做1个单层梯度。射出精子简单洗涤后，留取少量沉淀重悬后置于梯度上层；睾丸取精者将撕碎后的曲细精管混悬液置于梯度上层。200g离心10 min，剩余沉淀约0.05 ml，混匀后置于6%CO2培养箱准备授精。

3.ICSI及胚胎评估：将在 6%CO2培养箱培养2 h的卵丘-卵母细胞复合体，拆除颗粒细胞。观察卵周间隙见第一极体(PB1)提示卵母细胞核成熟(MⅡ)，进行ICSI。显微注射后16～20 h时观察受精情况，根据有无两个原核(2PN)及两个极体(2PB)出现来判断是否受精。根据中华医学会生殖医学分会(CSRM)实验室操作专家共识进行胚胎评估[16]。

4.胚胎移植及妊娠结局：新鲜胚胎移植选择1～2枚3级以上D3期胚胎进行移植，其余胚胎进行囊胚培养，达到冷冻标准的进行冷冻。冻融胚胎移植采用人工周期进行内膜准备，所有操作均按科室标准操作规范(SOP)进行，常规进行黄体支持。胚胎移植后14 d血β-HCG值超过20～50 U/L为HCG阳性。妊娠7周B超下见宫内孕囊为临床妊娠。确认妊娠后，孕12周内自然流产(生化妊娠除外)为早期流产。

三、观察指标

1.患者基本资料：包括不孕时间、不孕类型、双方年龄、卵泡刺激素(FSH)、女方体质量指数(BMI)、AMH及男方睾丸体积(采用Prader睾丸模型测量)。

2.临床和实验室指标：包括COH方案、促性腺激素(Gn)使用时间、Gn用量、获卵数、成熟卵数、2PN受精数、2PN受精率、卵裂胚胎数、优质胚胎数、优质胚胎率、可利用胚胎数和卵母细胞利用率。

3.结局指标：无可移植胚胎周期率=无可移植胚胎周期数/取卵周期数×100%；全胚冷冻周期率=全胚冷冻周期数/有可移植胚胎的周期数(治疗周期数-取消周期数-无可移植胚胎周期数)×100%；新鲜移植周期临床妊娠率=临床妊娠周期数/新鲜移植周期数×100%；新鲜移植周期流产率=流产周期数/新鲜移植周期妊娠数×100%；冻胚移植周期临床妊娠率=临床妊娠周期数/冻胚移植周期数×100%；一次 COS 累积活产率=获得活产的患者数/一次 COS 患者数×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；出生性别比(出生男婴或女婴人数/出生总人数×100%)。

四、统计学分析

结 果

一、患者基本资料

本研究共纳入58对男性sOAT的患者夫妇，他们共接受了98个ICSI周期，每对夫妇接受了1～4周期ICSI治疗，其中56个周期(57.14%)使用射精精子，42个周期(42.86%)使用睾丸精子。

两组患者的不孕年限、不孕类型，女方年龄、BMI和AMH水平，男方年龄、FSH和睾丸体积，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者基本资料比较[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

二、患者的促排卵、受精及胚胎发育情况

两组患者的促排卵方案、Gn使用天数、Gn用量、HCG日E2及P水平、获卵数、成熟卵数、2PN受精数及受精率、卵裂胚胎数、优质胚胎数、优质胚胎率、可利用胚胎数和卵母细胞利用率的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者促排卵、受精及胚胎发育情况比较[(-±s)，M(P25，P75)，%]

三、临床结局

两组患者新鲜胚胎移植周期取消率、新鲜胚胎移植周期临床妊娠率、冻融胚胎移植周期临床妊娠率、流产率、一次 COS 累积活产率、多胎妊娠率及出生性别比的组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者临床结局比较(%)

讨 论

临床上，sOAT(包含隐匿精子症)并不罕见，一般表现为FSH水平增高、睾丸萎缩和不育。虽然已经报道了多种病因，如染色体异常、生殖系统感染、精索静脉曲张、吸烟和过量饮酒等，但这些男性中的大多数人都很健康，很少能明确精子发生受损的原因[17]。本研究中的研究对象排除了染色体异常人群，2例反复受精失败的患者进行了男性不育基因高通量测序(NGS) panel检测(具体操作参照之前文献[18])，但均未发现异常，最终这2对夫妇在医生的建议下考虑供精人工授精(AID)治疗。2例患者曾患腮腺炎性睾丸炎致一侧睾丸萎缩。所有患者无Ⅲ°精索静脉曲张，轻、中度的精索静脉曲张未行手术治疗。目前除了低促性腺激素性性腺功能减退症，sOAT尚无具有循证医学证据的药物治疗，尿促性素(HMG)/FSH[19]和雌激素受体调节剂[20]显示出一些积极的治疗效果。此外，缩短禁欲时间可能会提升sOAT患者的妊娠率[21]。

目前，精液严重异常患者的射精精子和睾丸精子，与胚胎发育以及临床结局之间的关系仍然存在争议。Kahraman 等[22]在 1996年首次报道了完全不动精子和初始不动精子，且同时伴有严重畸形精子的男性，使用睾丸精子进行 ICSI获得临床妊娠，结果表明，在这些夫妇中，睾丸精子组和射精精子组的受精率及卵裂率均无显著性差异，但睾丸精子的妊娠结局优于射精精子。Weissman等[23]报告了4例患者，他们在使用射出精子反复植入失败后，改用睾丸精子进行 ICSI 获得了妊娠和活产。此后，又有不同的研究得出了睾丸精子妊娠结局优于射精精子的结论[24-25]。分析原因，可能是睾丸精子中DNA损伤程度较低[26]，而射精精子的DNA碎片指数(DFI)增加导致精子凋亡(但能运动且仍然存活)[27]。

本研究对我院因男方sOAT接受ICSI助孕的患者资料进行了回顾性分析。结果表明，睾丸精子ICSI组较射出精子ICSI组，虽然具有更低的周期取消率(11.9% vs. 21.4%)，更高的临床妊娠率(新鲜周期27.0% vs. 22.7%，FET周期66.7% vs.35.7%)和累积活产率(40.5% vs.25.0%)，但是组间差异尚未达到统计学意义(P>0.05)。一项包括了五项队列研究的Meta分析显示，隐匿精子症的男性，射出精子和睾丸精子ICSI的受精率和临床结局均无显著性差异，不支持优先使用睾丸精子ICSI[28]。Al-Malki等[11]评估了一组严重或完全弱精子症的不育夫妇接受TESA-ICSI的结果发现，与射精精子ICSI组比较，TESA组的受精率显著降低，但每次胚胎移植的临床妊娠率并没有显著差异。Gilman等[12]研究了在卵巢反应差和既往 ART 失败史的女性使用射精精子和睾丸精子行ICSI的临床结局差异，结果发现，与射精精子组相比，睾丸精子组的囊胚形成率更高，但是临床结局相似，表明睾丸取精并没有为患者带来益处。Inal等[29]同样认为射精和手术取精的围产期结局没有显著差异，睾丸取精手术却会导致如血肿、感染、疼痛、睾酮水平的变化等不良反应，因此建议在可行的情况下，应优先使用射精精子，而不是睾丸取精。本研究的结果与这些研究基本一致。

本研究存在一些局限性。首先，因为纳入患者的活动精子和/或总精子数量极低，绝大多数患者未达到精子DFI检测标准而未评估。DFI的检测是将精子染色后观察，很难确定DFI正常的精子是否是为数不多的几个形态正常的活精子，从而降低了DFI检测在sOAT患者中的应用。其次，受我院sOAT患者人数的限制，本研究的样本量相对较小，结果可能存在一定的偏倚性，需要通过进一步积累患者，或开展多中心的前瞻性合作来更新研究结果。

综上所述，基于本研究的结果，sOAT患者睾丸精子较射出精子并没有改善ICSI妊娠结局，暂不推荐sOAT患者直接选择睾丸精子进行ICSI。只有当射出精液离心后未发现正常形态活精子的情况下，再选择睾丸精子作为继续ICSI的补救性手段。