周时均，邓珊珊，梅 伟，刘 芳

（清镇市养殖业发展服务中心，贵州贵阳 551400）

巴氏杆菌属于巴氏杆菌科、巴氏杆菌属，是一种革兰氏阴性球杆菌，有荚膜，不形成芽孢、无鞭毛，可引起包括鸡、火鸡、鸭、鹅等在内的禽类的一种出血性、败血性传染病，称为禽巴氏杆菌病，又称禽霍乱[1]。该菌是重要的畜禽病原菌，宿主范围广泛，致病性强，病型多样[2]。禽类感染该菌具有较高的死亡率，并导致禽类生产性能低下，严重威胁养殖业的健康发展。

巴氏杆菌的血清型主要以荚膜抗原和脂多糖抗原来进行区分，根据荚膜抗原可分为A、B、D、E 和F 5 个血清型。常用的分型方法有血清学分型方法和分子分型方法。血清学方法是在传统免疫学实验技术的基础上建立的，其缺点是操作过程复杂，耗时比较长，工作量大，对抗血清的特异性要求较高，不适合于临床上进行大规模的流行病学调查。分子分型方法包括荚膜多重PCR 方法、脂多糖多重PCR 方法、多位点序列分型、全基因组测序和脉冲凝胶电泳。分子分型方法具有快速、简单、灵敏等特点，其缺点是仪器设备比较昂贵，检测费用相对较贵，技术难度大，在基层推广难度比较大。在实际的检测和分型过程中常常将传统的血清学分型方法和分子分型方法相结合，两种方法相互补充。

贵州省清镇市某发病肉鸡养殖户肉鸡存栏5000只，60 日龄时开始发病死亡，病鸡临床症状表现为精神萎靡，采食量下降、消瘦，两翅下垂，呼吸不畅，鼻腔有黏液等。剖检病鸡可见肝脏有灰白色坏死点，肾脏肿大，肌胃出血，腺胃乳头出血，十二指肠弥漫性出血等病变。初步怀疑为禽霍乱，为进一步确诊该肉鸡养殖场肉鸡异常死亡的病因，采用肝脏组织触片镜检、细菌分离培养、生化试验、PCR 检测、药敏试验等实验室诊断方法，为后期防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料

选择患病鸡3 只，无菌采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织病料。

1.2 主要试剂和培养基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；禽流感病毒通用型实时荧光定量PCR 检测试剂盒、新城疫病毒通用型实时荧光定量PCR 检测试剂盒，购自北京森康生物技术开发有限公司；试验所用的抗菌药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司，试验所用的鲜血琼脂平板由实验室自行制备。

1.3 细菌分离培养

采集病死鸡肝脏组织进行触片，火焰固定后瑞氏染色，光学显微镜下油镜观察细菌形态。

分别无菌接种3 只受检鸡的脾脏、肝脏组织于新鲜血琼脂平板，置于37℃恒温培养24h 后观察菌落生长情况。菌落纯化后进行革兰氏染色，光学显微镜下油镜观察细菌形态。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 细菌生化试验

按照巴氏杆菌生化鉴定图谱选择微量生化鉴定管，取分离菌纯培养物，接种于微量生化鉴定管，37℃恒温培养24～48h，观察并参照对照手册判定反应结果。

1.4.2 细菌PCR 检测

挑取适量的细菌纯培养物，参照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。根据针对多杀性巴氏杆菌KMT 基因，应用引物KMT1/KMT2 进行PCR鉴定，引物序列为：上游引物KMT1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；下游引物KMT2：5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′，预期扩增片段大小为457bp。采用25μL 反应体系进行PCR 扩增，扩增程序为95℃预变性3min，然后进入95℃变性45s、60℃退火45s 和72℃延伸45s 的35 次循环，最后72℃再延伸10min。扩增产物进行电泳检测，观察是否有特异性目的条带。

1.5 细菌药敏试验

药敏试验采用药敏纸片琼脂扩散法，参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的标准进行，药敏结果判断标准按NCCLS2010 年标准，作出结果判断。

1.6 相关病毒核酸检测

分别取3 只病死鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织病料各1g 于灭菌研钵中加入生理盐水1mL 快速研磨匀浆后转入1.5mL 无菌离心管中8000r/min 离心2min，分别移取上清液100μL 于另1 支1.5mL 无菌离心管中按照DNA/RNA 提取试剂盒说明书方法提取样品的总核酸，-20℃保存备用。分别对提取的核酸进行禽流感、新城疫病毒荧光定量PCR 核酸检测，具体操作步骤按照试剂盒说明书。

2 结果

2.1 细菌分离培养及形态

鲜血琼脂平板生长出表面光滑湿润、边缘整齐、半透明、灰白色呈露滴状菌落，见图1。感染动物肝脏组织触片瑞氏染色可见两极浓染的短小杆菌，呈蓝色，见图2。挑取单个菌落进行纯培养，经革兰氏染色，镜检显示分离菌为革兰氏阴性短小杆菌，呈单个存在或成双排列，见图3。

图1 细菌分离培养

图2 瑞氏染色结果

图3 革兰氏染色结果

2.2 细菌鉴定结果

2.2.1 细菌生化鉴定结果

生化鉴定结果显示，该分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇，不发酵乳糖和麦芽糖，硫化氢、氧化酶和吲哚等试验均为阳性，苯丙氨酸、硝酸盐还原、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸试验等均为阴性，符合巴氏杆菌生化特征。结合细菌形态观察和生化鉴定结果可初步判定该分离菌为巴氏杆菌。

2.2.2 细菌PCR 检测结果

取PCR 扩增产物8μL，于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统观察，结果显示巴氏杆菌阳性对照和分离菌样本在457bp 处均出现特异性条带，结果见图4，可得该次分离得到的细菌为鸡巴氏杆菌。

图4 分离菌PCR 扩增结果

2.3 细菌药敏试验

选取分离得到的巴氏杆菌分离株进行药敏试验，结果为分离菌对四环素、多西环素、头孢拉定、诺氟沙星等抗菌药物呈现良好的敏感性，对氨苄西林、青霉素等药物耐药。

2.4 相关病毒检测结果

分别对提取的核酸进行禽流感、新城疫病毒荧光定量PCR 核酸检测，检测均无明显的扩增曲线且无CT 值，说明各组织样品不存在禽流感病毒和新城疫病毒感染。

3 诊断结论

采用过肝脏组织触片镜检、细菌分离培养、生化试验、PCR 检测、药敏试验等实验室诊断方法，确诊该肉鸡养殖场鸡异常死亡的病因为鸡巴氏杆菌感染。药敏试验发现，分离菌对四环素、多西环素、头孢拉定、诺氟沙星等抗菌药物呈现良好的敏感性。

4 小结

巴氏杆菌实验室诊断的方法有病原学检测、血清学方法和现代分子生物学技术。病原学检测包括传统的细菌分离培养、生化试验、琼脂扩散试验等。血清学诊断方法主要是ELISA 方法。现代分子生物学技术包括普通PCR 方法、荧光定量PCR 方法、多重PCR方法、环介导等温扩增技术、基因芯片等。在临床诊断过程中常将细菌分离培养和PCR 技术相结合，更准确、更快速地进行病例确诊。

巴氏杆菌不同血清型之间无交叉免疫保护[3]，这给疫苗免疫预防带来了困难。在临床上主要采用抗生素药物进行治疗，但是由于大量抗生素药物的滥用，造成不同程度的耐药。因此选择合适的敏感药物，对治疗和预防鸡巴氏杆菌病至关重要。巴氏杆菌为条件性致病菌，当动物机体抵抗力下降时常引起发病[4]，因此加强饲养管理对预防巴氏杆菌至关重要。

清镇市属于亚热带季风湿润性气候，全年空气湿度较大，光照条件较差，降雨较多，容易引起细菌滋生。在饲养家禽的过程当中，要科学配比投喂饲料，保证营养摄入。加强环境卫生清洁，及时清扫鸡舍环境粪便，保持环境通风、干燥、清洁。注意防止饲料霉变，鸡群还要注意保暖，较少应激。提高鸡群抵抗力，按照全进全出的养殖模式。制定严格的生物安全防护措施，定期开展清洗和消毒，尤其是墙面、地面、进出入车辆以及槽具，应进行彻底的消毒，同时注意交替使用消毒药物，避免产生耐药性。定期对常发疾病进行监测，及时预警预报，淘汰隐性感染鸡群。在饲料中适量添加预防性药物，及时杀灭有害病菌。针对病禽要及时做好隔离治疗，病死禽及时进行无害化处理。鸡群做好高致病性禽流感和新城疫等疫病的免疫工作，加强免疫抗体监测，做好免疫评估。