袁兵杰，张奕菲，刘 佩，王 娜，郑腾飞，祁艳霞,2*

（1.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003；2.洛阳市动物遗传育重点实验室，河南洛阳 471003）

小眼畸形相关转录因子（Microphthalmia-Associtated Transcription Factor，MITF)最早由德国科学家Hertwig 于1942 年在突变小鼠后代中发现，并将该突变位点命名为mi，突变个体表现为毛色、虹膜色素退减、小眼畸形和耳聋。在1993 年，最先由Hodgkinso从小鼠中克隆得到对应的mi 位点基因MITF[1]。MITF属于MITF 转录因子家族，该基因编码区有9 个外显子，编码419 个氨基酸，MITF 基因编码的蛋白具有基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（basic-Helix-Loop-Helix-LeucineZip-per，bHLHZip)结构[2]，该结构横跨90 个氨基酸，基础部分由11 个氨基酸组成，是MITF 蛋白的转录激活结构功能区，另外在N-末端和C-末端分别具有一个强转录激活结构功能区和一个富含丝氨酸的激活域[3]。本实验的目的是通过PCR-SSCP 方法寻找多态性位点，探索MITF 基因与朝鲜鹌鹑羽色之间的关联性。

MITF 蛋白是一种核蛋白，参与并调节成黑色素细胞和黑色素细胞的生长发育。试验证明，MITF 基因突变使得黑色素合成受阻，小鼠毛色表型呈现为白色皮毛[4]。本实验选取北京白羽鹌鹑和栗羽朝鲜鹌鹑，提取DNA 后对目的基因进行扩增并检测，利用不对称PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析以确定突变位点，分析各SNP 位点与羽色性状的关联性，用以后续总结分析，得到此项内容具有一定的研究价值。

1 材料与方法

1.1 试验动物

北京白羽鹌鹑和栗羽朝鲜鹌鹑取自河科大鹌鹑种业有限公司。随机选取300 枚北京白羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑（栗羽)受精蛋，于2020 年9 月份进行孵化，在孵化10d 时[5]采其翅组织样品，迅速投入液氮中保存用于提取DNA。

1.2 朝鲜鹌鹑基因组DNA 提取

DNA 提取采用上海生工生物工程有限公司的试剂盒，进行室温离心后收集DNA 溶液，可立即进行下一步试验或置于冰箱-20℃保存。

1.3 朝鲜鹌鹑MITF 基因不对称PCR-SSCP 分析

PCR 扩增分两次进行，第一次扩增反应体系：2×Taq Master-Mix 10μL，上下游引物各0.7μL，DNA 模板1μL 和ddH2O 7.6μL，总体积20μL。反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，36 个循环；72℃10min。反应所需的引物分别为MF3S、MF4S、MF5S（表1)。将目的基因PCR 扩增产物于110V 电压下，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳对其进行检测，随后将所得的产物置于冰箱保存备用。第二次PCR 反应体系：第一次PCR 扩增产物1μL，上游引物或下游引物0.7μL，2×Taq Master-Mix10μL，最后加水至20μL。反应条件同第一次PCR，20 个循环。对目的基因PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并置于冰箱保存备用。

表1 朝鲜鹌鹑MITF 基因引物信息

1.4 不对称PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝胶电泳及分析

取8μL 第二次扩增产物和2μL 6×loading buffer混合均匀，4℃下在12%的聚丙烯酰胺凝胶[V（丙烯酰胺)∶V（亚甲双丙烯酰胺)=29∶1]上200V 电泳15min 后，调整电压至100V，电泳10h，（具体电泳时间根据片段大小不同可进行调整)。电泳完毕后，取下玻璃板，进行染色，拍照保存，进行分析。每个基因型个体分别选取3 份PCR 扩增产物，送去测序，对比分析以确定突变位点。

1.5 SNP 位点与羽色性状的关联性分析

计算基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC)，并运用皮尔逊卡方检验检测朝鲜鹌鹑群体是否处于Hardy-Weinberg 平衡。利用SPSS13.0 进行χ2独立性检验，分析各SNP 位点与羽色性状的关联性。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果

图1 为北京白羽鹌鹑和栗羽朝鲜鹌鹑MITF 基因外显子4、外显子5 和3′UTR 的PCR 扩增结果，其片段长度分别为199、191 和185bp。产物条带清晰、无杂带，可以用于后续测序分析。

图1 鹌鹑MITF 基因PCR 产物的电泳检测

2.2 MITF 基因不对称PCR-SSCP 电泳分析

经不对称PCR-SSCP 分析，MITF 基因扩增片段中均有2 个等位基因：A 和B，有3 种基因型：AA、BB 和AB，如图2 所示。

图2 鹌鹑MITF 基因扩增产物不对称PCR-SSCP 分析

2.3 不对称PCR-SSCP 测序结果分析

选取AA 型、AB 型和BB 型个体PCR 产物各3份进行测序，结果显示有3 个突变位点，如图3 所示，分别为c.589A＞G、c.761A＞G 和位于3′UTR 的c.2275C＞T，其中c.589A＞G 碱基的突变使得赖氨酸变为谷氨酸，如图4 所示，且在3′UTR C＞T 的突变可能改变MicroRNA 结合，导致基因转录活性改变，具有一定的研究价值。

图3 鹌鹑MITF 基因3 个突变位点的序列比对分析

图4 MITF 基因c.589A＞G 突变导致编码蛋白氨基酸的改变

2.4 鹌鹑MITF 基因突变位点的遗传信息分析

在鹌鹑群体中MITF 基因的3 个SNP 中的优势等位基因频率分别为0.68、0.68 和0.65，其中c.589A＞G 和c.761G ＞A 位点的优势等位基因为A，c.2275C＞T 位点的优势等位基因为B。对群体多态信息含量分析发现，3 个突变位点均表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5)（见表2)。对3 个多态位点进行Hardy-Weinberg 平衡检验，鹌鹑群体在c.589A＞G、c.761A ＞G 和 c.2275C ＞T 3 个位点都达到Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05)（见表3)。

表2 MITF 基因不同基因型的群体遗传学分析

表3 MITF 基因不同突变位点的Hardy-Weinberg 平衡检测

2.5 鹌鹑MITF 基因突变位点与羽色的关联性分析

对朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑2 个群体的3 个多态位点进行个体基因分型，计算各个突变位点的基因频率和等位基因频率，利用SPSS 13.0 软件进行显著性检验，并分析两种羽色群体各突变位点基因型与羽色性状的关联，结果见表4。由表4 可知，在c.589A＞G 位点，两个羽色群体之间基因型分布存在极显著差异（P＜0.01)。同时，在c.2275C＞T 位点，两个羽色群体之间基因型分布存在显著差异（P＜0.05)。由此可以推断，MITF 基因的c.589A＞G 和c.2275C＞T 突变位点可能与朝鲜鹌鹑羽色性状具有一定的关联性。

表4 朝鲜鹌鹑MITF 基因多态性与羽色性状的关联性分析

3 讨论

动物不同的被毛颜色与羽毛颜色一直是育种工作者关注的主要问题。动物黑色素变异性沉着是肉眼可见的表型性状[6]，是众多基因共同作用的结果。黑色素的合成是酪氨酸酶催化体内酪氨酸羟化而启动的一系列反应过程。酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白1 和多巴色素互变异构酶功能紊乱会导致黑色素沉着失调[7]。本试验通过设计3 对引物，分别扩增MITF 基因外显子4、外显子5 和3′UTR 的DNA 序列片段，利用不对称PCR-SSCP 技术分析，于外显子4、外显子5和3′UTR 的DNA 序列片段均发现三种基因型，即AA、AB 和BB，测序后经DNAMAN 软件比对发现3 个突变位点，皮尔逊卡方检验表明朝鲜白羽鹌鹑群体在c.589A ＞G、c.761G ＞A 和c.2275C ＞T位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P＞0.05)。在c.589A＞G和c.2275C＞T 位点处栗羽朝鲜鹌鹑的3 种基因型（AA、AB 和BB)的频率分布与北京白羽鹌鹑的3 种基因型频率分布存在显著差异（P＜0.01)，说明该突变位点与鹌鹑羽色之间存在一定的关联性。这与黄晶[8]研究结果相一致，另有学者研究表明，纯合子日本鹌鹑和杂合子日本鹌鹑羽色性状的差异是由MITF 基因第11 外显子的缺失[9]引起的，推测可能是MITF 基因的突变导致基因转录和翻译效率降低，引起蛋白功能、活性和空间构象的改变，另外由于MITF 基因调控黑色素合成过程[10]，虽然非编码区突变不会引起氨基酸的改变，但因改变了碱基组成，有可能影响转录，也可能存在对基因表达的影响，因此推测朝鲜鹌鹑群体中被毛颜色表现较深可能与群体中等位基因A 或B为优势基因有关。3′UTR 区域SNP 位点的同义突变虽未改变氨基酸结构，但可能改变MicroRNA 结合，导致基因转录活性发生改变，因此具有进一步的研究价值。

4 结论

本试验对朝鲜鹌鹑MITF 基因的部分序列进行多态性分析，结果显示，位于MITF 基因外显子4 的突变位点（c.589A＞G)使得赖氨酸变为谷氨酸，该突变与朝鲜鹌鹑的羽色存在显著关联性，另外位于3′UTR 处的c.2275C＞T 突变也与朝鲜鹌鹑的羽色存在显著关联性，但其具体的影响机制需进行下一步深入研究。