张衡以挺

胰腺癌在发达国家的5年生存率＜5%，预后较差［1］。大量研究表明，姜黄素是一种高效的抗炎物质，可改善糖尿病、肥胖症等的预后［2］。姜黄素在糖尿病心肌病中有抑制细胞生长和诱导细胞凋亡的作用［3］。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是高度保守的细胞周期蛋白家族的一员，是细胞周期蛋白依赖性激酶的重要调节因子，通过抑制细胞周期抑制剂来控制细胞周期G1/S转换表达式，与多种肿瘤存在密切的关系［4］。NF-κB信号通路被公认为连接炎症和癌症的主要信号通路，靶向抑制NF-κB可能同时针对癌细胞和癌症相关炎症，可改善患者预后［5］。有研究表明，姜黄素在凝胶迁移率变化测定中降低胰腺癌细胞NF-kappaB与DNA结合的能力［6］。本文探讨姜黄素对NF-κB通路和Cyclin D1通路的调控作用，及对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物及试剂 BxPC-3细胞系购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。BxPC-3细胞系在含有10%FBS（Gibco）、100μg/mL链霉素和100μg/mL青霉素的DMEM（Gibco）培养基中培养。所有细胞系均在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。姜黄素（Curcumin）购自MCE公司（美国），使用二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）溶解，CCK-8试剂盒购自碧云天（中国）；RIPA裂解液购自碧云天（中国）。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天（中国）；PVDF膜购自Millipore公司（美国）；柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自生工（中国）；PrimeScript™ RT Master Mix购自TAKARA公司（日本）；Cleaved Caspase3、Caspase3、Bax、Bcl2、NF-kappaB、p-NF-kappaB和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody抗体购自CST公司（美国）。实验时间 2021年10月至2021年11月。

1.2 细胞增殖试验 取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔103个细胞，每组设3个重复。将10、20、30、40、50、60μmol/mL的姜黄素加入BxPC-3细胞处理48 h，将CCK-8试剂加入96孔板，CCK-8试剂：培养基体积比为1∶10。37℃培养1 h后，在460 nm波长处测量吸光度。

1.3 实时定量PCR 使用柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取BxPC-3细胞的总RNA。通过PrimeScript™ RT Master Mix 逆转录已提取到的RNA为cDNA，后续通过Bio-Rad系统进行PCR扩增反应。反应体系为10μL，包括5μL SYBR Green Mix，10μmol/mL正向和反向引物，各1μL，模板2μL和无核酶水1μL。反应程序如下：95℃3 min，40个循环，每个循环95℃ 10 s，60℃30 s。为了确定扩增特异性，对每个引物对的扩增产物进行熔解曲线分析。具体引物见表1。

表1 PCR使用的引物

1.4 Western Blot 使用预冷的PBS洗涤铁壁细胞，使用RIPA裂解缓冲液在冰上裂解细胞15 min并用细胞刮刀刮下细胞。在4℃，1,200 r/min离心15 min后，转移细胞上清液至EP管，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。根据定量分析结果将蛋白调至相同浓度，加入5×上样缓冲液混匀，100℃变性5 min。稍微冷却并离心后，将蛋白质进行SDSPAGE凝胶电泳。电泳后，将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，切割目标蛋白条带，用含5%脱脂奶粉（25 mM Tris、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.5）与一抗在4℃下孵育过夜。次日，TBST洗3次后，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，化学发光液显色。

1.5 统计学方法 采用Graphpad prism 8.3软件。计量资料以（±s）表示，用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素抑制BxPC-3细胞的增殖 40μg/mL姜黄素处理BxPC-3细胞48 h后细胞活力明显低于20μg/mL处理48 h（P＜0.05）。随着药物浓度的增加，每个孵育时间组的细胞活力逐渐下降（P＜0.05）。姜黄素对BxPC-3细胞系的抑制作用呈剂量和时间依赖性趋势。后续实验选取40μg/mL处理48 h作为处理条件。见图1。

图1 姜黄素对BxPC-3 细胞活性的影响

2.2 姜黄素对胰腺癌细胞系BxPC-3凋亡的影响 为了确认姜黄素对细胞胰腺癌细胞系BxPC-3凋亡的影响，用RT-PCR和蛋白质印迹分析在姜黄素处理相同条件下细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的组成型表达水平及Caspase-3的激活。结果证实与对照组相比，用姜黄素处理BxPC-3细胞后，凋亡蛋白Bax的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下调，Bax/Bcl-2比值上升，剪切的Caspase-3增多（P＜0.05）。表明姜黄素可能通过增加Bax/Bcl-2比值诱导胰腺癌细胞凋亡，从而激活caspase-3。见图2。

图2 姜黄素对BxPC-3 细胞中凋亡相关蛋白表达量的影响

2.3 姜黄素降低CyclinD1的表达 姜黄素处理可抑制其蛋白质和mRNA表达水平，表明姜黄素通过CyclinD1停滞细胞周期。见图3。

图3 姜黄素对BxPC-3 细胞中CyclinD1表达量的影响

2.4 姜黄素下调NF-κB信号通路的激活 与对照组比较，姜黄素处理BxPC-3细胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低（P＜0.05），表明姜黄素可能抑制NF-κB信号通路的活化。见图4。

图4 姜黄素对BxPC-3 细胞中NF-kappaB通路激活情况的影响

3 讨论

姜黄，是姜科的草本植物。该植物产生多种次生代谢产物，包括黄酮类、生物碱类、单宁类和酚酸类，其中活性疏水性多酚二亚甲基甲烷（姜黄素）尤为引人注目。姜黄素用于治疗各种疾病，包括炎症性疾病、肝病、代谢综合征、神经退行性疾病，最重要的是，用于治疗多种癌症。大量研究表明姜黄素在体外对多种恶性细胞系具有有效的抗肿瘤作用，并在裸鼠模型中具有化学预防作用，这一作用主要通过诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖实现［7］。MARQUARDT等［8］发现姜黄素可通过阻断NF-κB通路治疗预后不良的肝癌患者。HAN等［9］发现姜黄素通过下调microRNA-27a抑制胸腺癌细胞的细胞活力、迁移和侵袭。本研究结果表明，不同浓度姜黄素对胰腺癌细胞系BxPC-3的细胞增殖有一定的抑制作用，并促进细胞凋亡。

Bcl-2作为抗凋亡因子，Bax蛋白作为促凋亡蛋白，参与细胞凋亡。研究结果表明姜黄素可通过减少抗凋亡因子Bcl-2，增加促凋亡蛋白Bax，减少Bcl-2/Bax比值诱导细胞凋亡。细胞凋亡取决于起始Caspase（例如Caspase-8和-9）和Caspase（Caspase-3、-6和-7）［10］。化疗药物通常通过PARP-Caspase3通路诱导癌细胞凋亡［11］。本研究结果表明，姜黄素通过促进Caspase3剪切，诱导细胞凋亡。NF-kappaB通路在许多细胞过程中发挥重要作用，如细胞代谢、存活、分化、增殖、运动和血管生成［12］。近年来，越来越多的研究表明NF-κB与肿瘤耐药性相关，使NF-κB成为治疗癌症的新靶点［13］。NF-κB因子调节和控制各种蛋白质的表达，包括细胞因子和干扰素。这些蛋白质与炎症和癌症进展密切相关。姜黄素对NF-κB依赖性途径具有抑制作用，从而抑制肿瘤和诱导细胞凋亡。大量研究表明，NF-κB信号通路与细胞增殖、迁移和侵袭有关［14］。本研究结果表明，姜黄素处理BxPC-3细胞系后，NF-κB的磷酸化水平降低，表明姜黄素抑制NF-kappaB信号通路的活化，且与其诱导凋亡相关。在人类癌症中，细胞周期蛋白D1比细胞周期蛋白D2或D3更频繁失调，因此，已被更广泛地表征。CyclinD1的过度表达导致CDK活性失调、细胞在有丝分裂信号受限的条件下快速生长、绕过关键细胞检查点，并最终导致肿瘤生长。CyclinD1是已知的参与细胞周期停滞的关键分子，是增殖细胞G1期细胞周期调节所必需的［15］。本研究结果表明，姜黄素通过抑制细胞CyclinD1的表达而导致细胞生长停滞。

综上所述，姜黄素能抑制胰腺癌细胞系BxPC-3增殖、诱导细胞凋亡、促进细胞周期停滞，其作用机制与下调CyclinD1、抑制NF-κB活化有关。