弓雪钰，黄贤燕，陈正海，曹建国，戴锡玲

（上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

0 引言

披针新月蕨（Pronephrium penangianum）隶属于金星蕨科（Thelypteridaceae）新月蕨属（Pronephrium），主要分布于中国华南和西南地区，在印度、泰国等国家也有分布［1］.在形态学的研究方面，MA等［2］利用光学显微镜研究了金星蕨科8属16种蕨类的叶表皮形态，为金星蕨科植物的系统演化及分类提供依据.在金星蕨科配子体发育方面，BAO等［3］研究了东北地区金星蕨科的卵果蕨（Phegopteris connectilis）和沼泽蕨（Thelypteris palustris）的配子体发育过程，BLANCA等［4］研究了金星蕨科沼泽蕨属（Thelypteris）的5种蕨类植物的配子体发育过程，并且对它们的发育过程进行了比较.在生殖方面，ZHAN等［5］就金星蕨科针毛蕨属（Macrothelypteris）的普通针毛蕨（Macrothelypteris torresiana）的卵发生过程进行了研究.披针新月蕨还是一种重要的药用植物，具有抗菌、消炎和抗肿瘤等生物活性［6-10］，然而，有关披针新月蕨配子体发育和有性生殖方面的研究尚未有报道.因此，本研究利用显微观察技术对披针新月蕨配子体发育和卵发生过程进行了细胞学观察，为完善蕨类植物生殖生物学积累资料.

1 材料与方法

本实验选取的材料披针新月蕨孢子于2019年7月采自贵州省荔波县.凭证标本保存于上海师范大学（SHNU）蕨类植物实验室.

披针新月蕨孢子为8—10月成熟时采收.制备Knop’s培养基，并将接种相关的各种器皿放于高压灭菌锅中灭菌，接种整个流程在超净工作台中进行，而后将培养皿置于ZGX-300C型智能培养箱中培养.培养条件为光照18 h·d-1，光照强度2 000 lx，温度26℃；黑暗6 h·d-1，温度20℃.

利用解剖镜（Nikon SMZ1500）观察披针新月蕨配子体和颈卵器（archegonium）发育的各个阶段，用光学显微镜（Nikon E800）拍照记录.

2 观察结果

2.1 配子体发育

披针新月蕨孢子为褐色，二面型，孢子大小为28 μm×37 μm.赤道面观是半圆形，极面观是椭圆形，孢子具单裂缝，表面具有脊状纹饰（图版I-1）.接种后12 d左右，孢子萌发，长出初生假根（图版I-2）.此后，长出原叶体原始细胞.初生假根方向与原始细胞的长轴方向垂直，孢子萌发方式是书带蕨型（Vittaria-type）［11］.接种18 d后，原叶体原始细胞不断横分裂，形成4～7个细胞的单列丝状体（图版I-3～4），有时会纵向分裂，形成双列丝状体.接种22 d后，丝状体细胞不断的纵向分裂，形成片状体，形状不规则，顶部存在楔形分生细胞，片状体边缘细胞较小，含有丰富的叶绿体.此时，假根的数量也增多（图版I-5）.

图版I披针新月蕨配子体发育光学显微镜图.

接种39 d后，由于分生细胞分裂的速度较慢且体积小，而周边由分生细胞衍生的细胞体积大，从而使生长点两侧凸出，生长点下陷，发育为心脏形的幼原叶体，生长点附近的细胞较小，排列紧密（图版I-6）.接种后约46 d，幼原叶体继续发育，体积增大成为成熟原叶体（图版I-7～8），周围有大量的假根，在成熟原叶体边缘具有毛状体，多为单细胞圆柱状，上窄下宽，圆柱顶端具帽状腺体，大小不一，通常长约30～40 μm，宽约15 μm（图版I-9）.成熟原叶体长度为0.3～0.5 cm，宽度为0.3～0.4 cm.披针新月蕨的原叶体发育类型是槲蕨型（Drynaria-type）［11］.在成熟原叶体生长点下方，中肋附近长出颈卵器，一般有6～10个处于不同发育阶段的颈卵器（图版I-10），越靠近生长点附近的颈卵器越幼小.发育成熟的颈卵器侧面观一般由4～5层细胞构成，顶面观是“铜钱形”（图版I-11）.在颈卵器附近，靠近原叶体基部或原叶体边缘产生精子器（antheridium）.精子器为圆球形，由基细胞、环细胞和盖细胞组成，精子器内包含有许多精子（图版I-12）.

待精子成熟，盖细胞破裂，精子从精子器溢出，借助水进入颈卵器，完成受精，形成合子.合子发育为胚，胚暂时寄生在配子体上，长大后配子体死亡，孢子体独立生活.

2.2 幼卵阶段

披针新月蕨的颈卵器起源于生长点附近的原始细胞.原始细胞经过一次不等的平周分裂形成上下2个细胞，下方细胞较大，下方细胞再经过一次不等的平周分裂，最后形成3个细胞，分别是顶细胞、初生细胞和基细胞.其中位于最上层的顶细胞经过2次垂周分裂，最终发育成为4列颈卵器壁细胞（jacket cell of the neck）.处于下方的细胞为基细胞，含有较多液泡，经过发育成为颈卵器底部壁细胞.处于中间的细胞是初生细胞（PC）（图版Ⅱ-1），初生细胞继续发育，体积增大，细胞向上隆起（图版Ⅱ-2）.初生细胞经过一次不等平周分裂形成上下2个细胞，上方细胞比较小，是颈沟细胞（NCC）（图版Ⅱ-3），细胞核较大，含有较多的囊泡，围绕在细胞核周围.下方细胞继承了大部分的细胞质，体积较大，为中央细胞（CC），细胞核较大，核仁明显（图版Ⅱ-3）.此时，颈卵器壁细胞含有较多大囊泡.颈卵器壁细胞经过多次分裂形成明显的颈部（图版Ⅱ-4）.随着颈卵器的发育，单核颈沟细胞的细胞核先分裂，细胞质不分裂，形成双核颈沟细胞.接着，中央细胞开始不均等的分裂，形成上下两个细胞，上方细胞继承的细胞质较少，体积较小，被称作腹沟细胞（VCC）.腹沟细胞刚形成时，位于颈卵器中间，呈凸形，质体位于腹沟细胞的两侧.下方细胞继承了大部分的细胞质和细胞器，细胞体积大，被称作卵细胞（EC）.卵细胞横切面的形状近似“倒梯形”，细胞内含有丰富的囊泡和细胞器.幼卵阶段的颈沟细胞、腹沟细胞和卵细胞是紧密联系在一起的，之后随着发育颈卵器壁细胞逐渐液泡化.

图Ⅱ披针新月蕨颈卵器发育及卵发生光学显微镜图.1.初生细胞时期；2.初生细胞向上隆起；3.中央细胞时期；4.幼卵细胞时期：颈沟细胞、腹沟细胞和幼卵细胞；5～6.发育卵阶段：分离腔和孔区形成；7～8.发育卵阶段：卵膜和受精孔形成；9.成熟卵阶段

2.3 发育卵阶段

2.3.1 分离腔和孔区的形成

幼卵继续发育，其颈卵器壁细胞数量增多，有4～5层细胞，液泡化更明显.发育卵最明显的特征是卵细胞与腹沟细胞之间开始出现分离腔，分离腔最开始是在2个细胞的边缘先形成的（图版Ⅱ-5），卵细胞继续发育，分离腔不断地向中心扩大，最后只剩下一处与腹沟细胞相连，连接处称为孔区（图版Ⅱ-6）.腹沟细胞与颈沟细胞之间还是紧密联系的（图版Ⅱ-5～6），但腹沟细胞与颈卵器壁细胞开始出现间隙，腹沟细胞有轻微退化的趋势，颈沟细胞质体丰富，开始液泡化（图版Ⅱ-5～6）.

2.3.2 卵膜和受精孔的形成

卵细胞发育过程中的另外一个明显的特征是卵细胞表面有一层嗜锇性物质包裹着卵细胞，即卵膜.卵细胞发育过程中细胞核由椭圆形变成“碗状”，整个细胞中均匀分布着小囊泡和染色较深的质体.分离腔不断扩大，卵细胞与颈卵器壁细胞也逐渐分离.腹沟细胞细胞核周围有小囊泡分布.腹沟细胞与颈沟细胞还紧密联系着，与卵细胞只通过孔区相连.腹沟细胞边缘退化，与颈卵器壁细胞分离，两细胞之间有染色较深的絮状物质（图版Ⅱ-7～8）.在卵细胞上表面一侧未被卵膜覆盖的区域是受精孔（图版Ⅱ-8）.受精孔两边的卵膜较厚，远离受精孔两侧的卵膜较薄.颈沟细胞进一步伸长，细胞内一般含有2～3个较大的囊泡，细胞器退化（图版Ⅱ-7～8），在卵细胞发育后期，颈沟细胞明显退化，与颈卵器壁细胞分离，有絮状物质，颈沟细胞周围染色加深.

2.4 成熟卵阶段

卵细胞的卵膜染色加深，受精孔两侧的卵膜较其他地方的卵膜更厚，核仁明显（图版Ⅱ-9），卵细胞与腹沟细胞之间的分离腔进一步增大，与周围的颈卵器壁细胞分开.网状的卵膜进一步加厚，卵膜的下方有嗜锇性的囊泡，囊泡主要集中于卵细胞上方（图版Ⅱ-9）.此时，腹沟细胞已经完全退化，细胞核和细胞器消失，细胞内只有染色较深的絮状物质，且与颈沟细胞分开，颈卵器的壁细胞液泡化.与腹沟细胞一样，颈沟细胞也已经完全退化，细胞核和细胞器消失，只剩下大量的不定型物质（图版Ⅱ-9），颈卵器壁细胞已经完全液泡化，等到时期成熟，颈卵器壁细胞会裂开，不定型物质溢出颈卵器，颈卵器颈部形成空腔，为精子进入颈卵器做准备.

3 讨论

对披针新月蕨的配子体发育的研究结果表明，其孢子为褐色，二面体型孢子，具单裂缝和脊状纹饰［12］，与DAI等［12］的研究结果一致.披针新月蕨孢子萌发的方式是书带蕨型，原叶体发育类型是槲蕨型，且原叶体边缘有毛状体形成，成熟原叶体是对称的心形等，这些特征都表明其处于较为进化的蕨类植物［13］.

披针新月蕨的颈卵器发育过程经历了初生细胞、中央细胞、幼卵、发育卵和成熟卵时期，这与普通针毛蕨、瘤足蕨（Plagiogyria adnata）、多羽凤尾蕨（Pteris decrescens）［14］、阔叶鳞盖蕨（Microlepia platyphylla）［15］等的卵发育过程一致，表明同型孢子蕨类植物颈卵器的发育都经历了这几个时期.其中，在卵发生的过程中，比较特殊的是单核颈沟细胞细胞核分裂先于中央细胞分裂形成腹沟细胞，这与对普通针毛蕨［5］和阔鳞瘤蕨（Phymatosorus hainanensis）［16］的研究结论相同.披针新月蕨单核颈沟细胞细胞核分裂先于腹沟细胞形成，且只有一个颈沟细胞，这表明金星蕨科应该位于真水龙骨类当中，这为金星蕨科的分类增添生殖发育方面的佐证，因此，支持PPG-2016系统对于金星蕨科的划分，将金星蕨科放置于真水龙骨类当中［17］.

在披针新月蕨发育卵阶段，腹沟细胞与卵细胞并没有完全分开，还有一个孔区连接着两者，并且孔区处有胞间连丝存在，孔区形成的这些变化特征和较为进化的多羽凤尾蕨、普通针毛蕨、阔鳞瘤蕨、阔叶鳞盖蕨等［5，14-16］一样.这与处于原始地位的紫萁（Osmunda japonica）情况不一致，紫萁在卵发生过程中并未有孔区出现［18］，表明孔区是在蕨类植物演化过程中慢慢出现的，存在一个从无到有的过程，孔区结构是较为进化的蕨类植物所特有的结构.在披针新月蕨卵的发育过程中，颈沟细胞和腹沟细胞直到成熟卵时期才完全退化，只剩下大量的絮状不定型物质.到卵成熟时，颈卵器壁细胞破裂，絮状不定型物质释放出去，而颈沟细胞与腹沟细胞的退化起到了为精子提供通道的作用，使精子进入到卵细胞中，完成受精作用.结合过往研究［19-26］，推测絮状不定型物质可能起着吸引精子的作用，但是关于絮状不定型物质的这一特性还需进一步研究.

在披针新月蕨卵细胞发育过程中，分离腔中的不定型物质在卵细胞外表面不断堆积，加上卵细胞内表面的嗜锇性囊泡共同作用，形成卵膜，而在卵细胞上方偏离中心的孔区位置，没有卵膜的覆盖，进而形成受精孔.处于系统演化中较高级的阔鳞瘤蕨［16］、普通针毛蕨［15］等的受精孔位于卵细胞上方，偏离中心的位置，这和本研究中的披针新月蕨的受精孔情况一致；而处于较为原始的蕨类金毛狗（Cibotium barometz）、乌蕨（Odontosoria chusana）等的受精孔位于卵细胞上方的正中央［27-28］，并且紫萁是无受精孔结构的.而卵膜的形态结构在进化的蕨类植物中各有不同，因此，还需要更为细致的透射电子显微镜来进行观察，以进一步确定披针新月蕨的演化地位.

4 结论

本文采用显微观察技术，对披针新月蕨配子体发育和卵发生的过程进行了观察，结果如下.

1）配子体发育：孢子褐色，二面型，孢子萌发经丝状体和片状体阶段，发育成原叶体.孢子萌发是书带蕨型，原叶体发育是槲蕨型，成熟原叶体是心形，接种46 d后产生颈卵器和精子器.

2）颈卵器发育：颈卵器起源于原叶体生长点下方的原始细胞.原始细胞经过2次不等的平周分裂，形成3个细胞，分别是顶细胞、初生细胞和基细胞.其中，初生细胞不等分裂，形成中央细胞和颈沟细胞.随后，中央细胞不等分裂形成腹沟细胞和卵细胞.单核颈沟细胞细胞核分裂先于腹沟细胞形成，且只有一个颈沟细胞，这表明金星蕨科应该位于真水龙骨类当中.

3）卵发生：随着卵细胞成熟，颈沟细胞和腹沟细胞逐渐退化，但腹沟细胞通过孔区与卵细胞相连.卵细胞成熟后，细胞上表面具有明显的卵膜，其中央具有受精孔，孔区是较为进化的蕨类植物所特有的结构.

本研究对于完善蕨类植物生殖生物学和探讨蕨类植物的演化具有重要意义.