吴 燕,杜鸣飞,张 玺,王 兰,胡桂霖,牛泽家馨,邹 婷,张晓玉,褚 超,廖月圆,马 琼,王 丹,王科科,贾 昊,陈 晨,严 瑜,孙 月,郭统帅,张 婕,高卫华,满子悦,高 可,罗文婧,牟建军,汪 洋,6

(1.西安交通大学第一附属医院心内科,陕西西安 710061;2.西安国际医学中心医院心内科,陕西西安 710100;3.西北妇女儿童医院心内科,陕西西安 710003;4.西安市人民医院心内科,陕西西安 710004;5.西安市第一医院心内科,陕西西安 710002;6.西安交通大学全球健康研究院,陕西西安 710061)

高血压是心脑血管疾病及慢性肾脏病的主要危险因素,是严重危害人类健康的主要公共健康问题之一[1]。研究表明,高血压受遗传和多种环境因素的相互影响,其中高钠膳食与钾摄入量不足是高血压的重要环境因素[2]。同时,大量证据显示,不同个体的血压对饮食中钠钾摄入的反应性存在显著差异[3-4]。这表明遗传因素在决定个体血压的盐敏感性和钾敏感性方面起着重要作用。

尿调节素又称Tamm-Horsfal蛋白,是正常人尿液中占比最大的一种蛋白,由肾小管髓袢升支粗段上皮细胞产生[5]。尿调节素可以防止肾结石产生、尿路感染及调节免疫,是目前研究较多的生物学功能[5-6]。近年来研究发现,尿调节素基因的变异与钠钾稳态及高血压的发生与调节关系密切[7]。通过全基因组关联分析,PADMANABHAN 等[8]发现,尿调节素基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs13333226的次要G 等位基因与较低的高血压风险相关。TRUDU 等[9-10]发现,尿调节素SNP rs4293393的主要T 等位基因与高血压相关。相较于野生型小鼠,尿调节素基因缺失小鼠血压显著降低;过表达尿调节素基因的小鼠血压显著升高。然而,关于基因与环境的互相作用尚未阐明,尤其是关于钠钾干预与尿调节素基因的关系,这也导致基因在血压变异中的作用无法精确评估。因此,本研究基于既往建立的陕西“盐敏感高血压研究队列”,通过对研究人群饮食进行钠钾干预,探讨尿调节素基因多态性与血压钠钾反应性的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本课题组在2003年10月—2004年10 月对陕西宝鸡市眉县多个农村汉族人群进行系统筛查,最终招募了来自124个家系的514名年龄在18～60岁之间,收缩压130～160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒张压85～100 mm Hg的受试者建立“盐敏感性高血压研究队列”。具体已在本课题组以往相关文献中详细报道[11-13]。本研究已经过西安交通大学第一附属医院伦理委员会审批通过,受试者均知晓研究内容并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基线调查及饮食干预 本研究如前所述[11-13],对选中的333名非父母者进行慢性盐负荷及补钾干预试验,具体分为四个阶段:3 d基线调查期、7 d低盐饮食期(3 g或51.3 mmol/L NaCl/d)、7 d高盐饮食期(18 g或307.8 mmol/L NaCl/d)和7 d高盐补钾期(18 g或307.8mmol/L NaCl/d+4.5 g或60 mmol/L KCl/d)。基线期调查主要包括年龄、性别、身高、体质量、体质指数、腰围、血压等基本资料的问卷调查。

1.2.2 血压测量 基线期与钠钾干预期的第5、6、7天采用随机零点血压计(Hawksley&Sons,英国)按标准方法测量血压,重复测量3次,最终统计分析时采用9次血压的平均值。平均动脉压、脉压计算公式为:平均动脉压=舒张压+1/3(收缩压-舒张压)。在本研究中,我们将血压对钠钾的反应性看作连续性变量,具体计算公式如下:低盐期血压反应性=低盐期血压-基线期血压;高盐期血压反应性=高盐期血压-低盐期血压;补钾期血压反应性=高盐补钾期血压-高盐期血压。

1.2.3 血、尿标本的收集与分析 在各个阶段的最后一天安排当地医院采集受试者的外周静脉血标本和24 h尿标本。清晨空腹采集4 mL静脉血,离心机的半径为16 cm,3 000 r/min离心15 min,将分离的血清标本存放在-80℃冰箱冷冻保存待测。收集受试者24 h 尿液标本并测量记录总体积,分别吸取4 mL尿标本存放于2 个冻存管内,存于-40℃冰箱。所有血尿标本处理好后于当天运送至西安交通大学第一附属医院采用Hitachi7060 全自动生化分析仪(日立,日本)检测尿标本中钠、钾浓度以及血清生化指标,包括血糖、血肌酐、三酰甘油、总胆固醇等水平。钠、钾排泄量用24 h尿液总体积乘以尿钠、钾浓度计算得到。

1.2.4 SNP 位点选择及基因分型 通过对美国国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)和基因组变异服务器数据库(http://gvs.gs.washington.edu/GVS147)进行检索,采用Haplo View 4.2软件(Broad Institute,Cambridge,MA,USA)在中国北京汉族(CHB)和亚洲人群数据库中筛选尿调节素基因中的标签SNP位点。具体筛选标准:该标签位点SNP 频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P≥0.05),次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)P≥0.05,且连锁不平衡系数r2≥0.8。最终纳入13个尿调节素基因相关的SNP 位点进行后续分析,分别为rs77875418、rs4293393、rs7193058、rs4997081、rs11859916、rs13333226、rs79245268、rs4632135、rs4383153、rs12708631、rs7198000、rs6497476、rs12917707。

采集全部受试者外周静脉血,应用Gold Mag-Mini纯化试剂盒(Gold Mag有限公司,中国)提取外周血脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。通过Mass ARRAY 检测平台对13个尿调节素基因有关的SNP位点进行分型。每种基因分型实验均由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。

1.2.5 统计学分析 统计分析采用SPSS 22.0软件进行。连续变量以均数±标准差()表示,分类变量以n(%)表示。采用独立样本t检验进行两组之间的比较,采用方差分析进行多组间比较。使用PLINK 软件(version 1.9)通过精确检验法对选取父母受试者的基因型进行平衡检验和孟德尔一致性检验,计算各基因型的MAF。利用PLINK 软件在不同遗传模型(加性模型,显性模型和隐性模型)下构建混合线性回归模型,截点乘积法(truncated product method,TPM)分析SNPs与人群血压钠钾反应性的关系。将年龄、性别和体质量指数作为固定效应,家系相关性作为随机效应在模型中进行校正。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 受试者的基线特征及血压的钠钾反应性

如表1所示,在基线期,先证者的收缩压、舒张压和平均动脉压均高于其同胞、配偶和子女。钠钾饮食干预时,与基线期血压相比,受试者低盐期血压明显下降,高盐期血压则显著升高,此外与高盐期相比,在高盐补钾期,血压显著降低(表1)。

表1 基线特征及饮食干预下的血压反应性Tab.1 Baseline characteristics and BP responses to dietary intervention

续表1

2.2 受试者各时期24 h尿液钠、钾的反应情况

基线期受试者的尿钠、尿钾排泄均呈现“高钠低钾”规律,提示日常钠摄入过多而钾摄入不足,符合中国北方农村居住者的饮食习惯。与基线期相比,低盐期24 h尿钠排泄量显著降低,高盐干预后显著升高,补钾可以显著升高24 h尿钾排泄量(表2)。这提示受试者对膳食干预依从性好。

表2 受试者各时期24 h尿液钠、钾的排泄量Tab.2 Urinary excretions of sodium and potassium in subjects during the intervention periods

2.3 尿调节素基因SNP位点的基本信息

由于本研究以家系为基础,故Hardy-Weinberg平衡检验仅在父母的数据中进行,表3罗列了本研究采取的SNP所在基因组位置、等位基因、MAF、Hardy-Weinberg检验结果及功能预测。结果显示,各SNP位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明受试者选自遗传平衡的大众人群,具有很强的代表性。

表3 尿调节素基因各SNP位点的基本信息Tab.3 Characteristics of the uromodulin SNPs analyzed in this study

续表3

2.4 尿调节素基因多态性与血压钠钾反应性的关联性

通过对所有位点与血压的钠钾反应性这一性状表型进行分析,尿调节素基因SNPs rs7193058、rs4997081与高盐期舒张压和平均动脉压反应性显著相 关(均P＜0.05)。此外,rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707与高盐补钾期收缩压、舒张压和平均动脉压反应性显著相关(均P＜0.05,表4)。

表4 尿调节素基因多态性与血压钠钾反应性的关联性Tab.4 Associations of renalase SNPs with blood pressure responses to salt and potassium interventions

3 讨 论

通过对陕西“盐敏感性高血压研究队列”进行钠钾膳食干预,本研究发现,尿调节素基因多个SNPs与血压钠钾反应性密切相关。其中rs7193058、rs4997081位点与高盐期舒张压和平均动脉压反应性显著相关;rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707 位 点与高盐补钾期收缩压、舒张压及平均动脉压反应性均显著相关。因此,以上SNPs可能作为盐敏感性和钾敏感性的遗传标记,并为高血压的治疗提供潜在的遗传靶点。

尿调节素基因由11个外显子组成,位于染色体16p12.3-16p13.11,转录子只特异性存在于肾脏中,其基因结构在人和小鼠体内均非常保守[5-6],尿调节素产生于肾小管髓袢升支粗段上皮细胞内质网,由高尔基体多聚糖加工,随后作为糖基磷脂肌醇连接分子被运送到顶端细胞膜,最后经蛋白酶水解切割后释放到尿液中。研究表明,尿调节素参与调节血压,促使血压升高。PADMANABHAN 等[8]通过全基因组关联分析发现尿调节素SNP 13333226的次要G 等位基因与较低的高血压风险相关。GRAHAM 等[10]研究表明SNP rs4293393的主要T 等位基因与尿调节素基因表达、慢性肾脏病及高血压相关。本课题组近期对“盐敏感性高血压研究队列”长达8年的随访,发现尿调节素基因SNPs rs12917707及rs12708631与远期的血压改变有关,SNP rs12708631与远期高血压的发病率显著相关(OR=1.344,P=0.035)。基于“汉中青少年高血压研究队列”的研究,在调整多种混杂因素后,血清尿调节素的水平与高血压风险显著负相关(OR=0.978,P＜0.001)[14]。在动物模型中,相较于野生型小鼠,敲除尿调节素基因的小鼠血压明显下降,并对盐诱导的高血压有抵抗力;尿调节素基因过表达的小鼠血压上升,并对呋塞米的利尿及降压作用更为敏感[10-11]。此外,有研究证实,尿调节素对钠水代谢的调节与肾小管髓袢升支粗段上皮细胞的Na+-K+-2CL-同向转运体(Na+-K+-2Cl-cotransporter,NKCC2)通道相关,上皮细胞内NKCC2在敲除尿调节素基因小鼠肾小管髓袢升支粗段表达上调,细胞膜侧NKCC2表达无显著变化,但磷酸化水平下降,其总体功能降低[15];尿调节素过表达小鼠的NKCC2 磷酸化水平上升[10]。以上研究提示尿调节素通过NKCC2参与钠水代谢的调节进而影响血压。本研究通过对陕西“盐敏感性高血压研究队列”进行慢性盐负荷及补钾干预,首次发现尿调节素基因多态性位点rs7193058、rs4997081 与高盐期舒张压和平均动脉压反应性明显相关。表明尿调节素基因可能参与盐敏感性血压的形成。

人群研究显示钠干预与血压呈正相关,补钾与血压呈负相关[2]。大量证据显示,补钾的降压作用存在个体差异性[3]。GenSalt研究显示,在遗传背景相似的中国汉族人群中,补钾的血压变化仍不同,表明人群存在血压的钾敏感性[16]。ZHAO 等[17]报道汉族人群Apelin(APLN)和血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因变异与补钾的血压反应有关。MONTASSER 等[18]研究发现,中国农村人群血管内皮通路包括内皮素1(endothelin,EDN1)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、E选择素(E selection,SELE)等关键基因的多态性与补钾反应性相关。本研究首次探讨尿调节素基因多态性与补钾的血压反应性的关系,结果表明SNPs rs77875418、rs79245268、rs4293393、rs6497476、rs4997081、rs13333226、rs12917707位点与高盐补钾期收缩压、舒张压及平均动脉压反应性显著相关,提示尿调节素基因可能参与血压钾敏感性的形成。尿调节素基因多态性对血压钾反应性的影响与肾外髓钾通道(renal outer medullary potassium channel,ROMK)密切相关。RENIGUNTA 等[19]发现尿调节素基因敲除小鼠细胞内ROMK 蛋白蓄积增加,而顶端膜侧表达量减低,通过酵母双杂交实验及免疫共沉淀等证实尿调节素与ROMK 存在相互作用。SCHIANO等[20]通过药物抑制或基因敲除小鼠肾小管髓袢升支粗段细胞ROMK,导致尿调节素分泌减少,细胞内尿调节素累积。以上研究表明,尿调节素可能通过ROMK 参与血压钾敏感性的调节,提示尿调节素为高血压潜在的治疗靶点。

综上所述,本研究发现尿调节素基因多态性与血压钠钾反应性相关,这有助于从遗传学角度进一步理解钾敏感性血压形成机制并为其防治工作提供思路。考虑到本研究存在样本量相对较小且受试者局限于中国北方人口等不足之处,因此,膳食钠钾盐的摄入与尿调节素基因多态性的关系及其在高血压的发生发展中的作用等方面的临床意义还有待大规模前瞻性研究予以证实。