高松城 王立雅 王惠洁 余秋锋 黄智勇

随着体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术的不断改进,人们正在寻找改进实验的方法,以此产生更高质量的胚胎和更高的临床妊娠率［1］。然而,仍然有一些IVF 周期中卵子未完全发育,约为10%～20%［2,3］。为了避免IVF 失败,越来越多的生殖中心采用短时受精方案,以尽早确认卵子的受精状态,并提供补救卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)的可能性［4,5］。常规的长时IVF 胚胎移植是在培养基中加入精子和卵子,培养过夜(16～18 h),受精后继续培养。然而,研究表明,哺乳动物在遇到配偶后20 min 发生受精,精子可以在平均15 min 内进入人类的卵子细胞［6］。80%的卵子在大约1 h 内通过与精子接触而发生改变。此外,颗粒细胞和精细胞代谢产生的活性氧化物引起不饱和脂肪酸的过氧化影响细胞膜流动性,强化细胞质膜,有助于胚胎的分裂、发育和促进发育；相关研究表明,短时IVF和早期补救ICSI 可以防止由于IVF 完全不受精而导致的周期中断,并产生更好的临床结局［7］。然而,短期精卵共培养和早期受精是否会改变IVF 周期中卵子的正常受精能力、胚胎发育潜力和临床结局仍存在争议。因此本研究对长时和短时受精患者进行回顾性分析,分析其对胚胎参数及妊娠结局的影响,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析本院2020 年6 月～2022 年5 月725 例进行IVF 的不孕患者的临床资料,根据IVF方式分为短时组(347 例)和常规组(378 例)。两组一般资料比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较()

表1 两组一般资料比较()

注：两组比较,P＞0.05；HCG：人绒毛膜促性腺激素

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①女方符合IVF指征且为第一助孕周期；②患者均为原发性不孕；③男方精液常规检查符合IVF 标准；④临床资料完整；⑤均为长效长方案。排除标准：①女方年龄≥40 岁；②合并有其他重大疾病者；③女方基础内分泌异常；所有研究对象均签署知情同意书,并经医院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 控制性促超排卵 所有患者均接受长效促性腺激素释放激素(GnRHa)降调,达到下调标准后给予促性腺激素(Gn)并利用阴道B 超及激素测定监测卵泡发育情况,当卵泡达到收针标准后进行HCG 注射促进卵子成熟,32～34 h 后B 超下经阴道穿刺采集卵细胞。

1.3.2 精液处理 根据世界卫生组织(WHO)标准,通过标准精液分析和巴氏染色对精子进行严格的形态学检查。取卵当天男子手淫取精,并将所有精子收集在无菌、无毒的容器中。收集的精液在37℃下液化并通过密度梯度离心洗涤及上游处理,将用于添加精子的浓度调整为5×106/ml,并置于37°C、6% CO2的培养箱中进行孵育,然后用于加精。

1.3.3 受精方案 常规组采用常规长时受精,取卵日14:30,将足够的上游精子添加到含有卵丘卵母细胞复合体 (COCs) 的3037 个培养皿中,每个卵子的平均精子数为(1～1.5)×106/ml,每箱3037 皿COCs 数≤8 个。短时组采用短时受精,加精时间为取卵日11:30,受精卵孵育4～6 h 后,将卵转移到另一个3037 培养皿,此时,卵周围仅剩少量卵丘细胞。

1.4 观察指标及判定标准 比较两组胚胎参数及妊娠结局,主要包括平均获卵数、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、优质胚胎率、平均移植胚胎数、冷冻周期率、平均冷冻胚胎数、种植率、临床妊娠率。优质胚胎：孵育第3 天的胚胎应为卵裂球大小均匀或轻度不均匀,细胞数为7～9 细胞,优质胚胎级别为1～2 级,胚胎碎片率＜20%。临床妊娠：移植后1 个月时通过超声观察存在妊娠囊。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

短时组的优质胚胎率高于常规组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；短时组平均获卵数、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、平均移植胚胎数、冷冻周期率、平均冷冻胚胎数、种植率、临床妊娠率与常规组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 两组胚胎参数及妊娠结局比较(,%)

表2 两组胚胎参数及妊娠结局比较(,%)

注：与常规组比较,aP＜0.05

3 讨论

据报道,短期受精(精子和卵母细胞共培养1～4 h)可提高胚胎质量和妊娠率［8］。短时受精可以在6 h 后观察第二极体的发射来确定受精状态,及时对未排出第二极体的卵子实施补救ICSI 是预防受精失败的有效方法［9］。因此,许多生殖中心正在逐步引入短时受精［10］。短时受精结合补救ICSI 可以有效减少大多数胚胎不受精造成的周期失败,其效果已经被临床认可［11］。然而,短期受精是否会影响卵子正常受精周期的受精潜力、胚胎的发育潜力以及妊娠的临床结局仍存在疑问,本研究调查了短时和长时受精对IVF 和临床妊娠结局的影响。

本研究中,对常规组采用常规长时受精,对短时组采用短时受精,结果显示,短时组的优质胚胎率48.87%高于常规组的37.29%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。两组平均获卵数、受精率、正常受精率、多原核受精率、卵裂率、平均移植胚胎数、冷冻周期率、平均冷冻胚胎数、种植率、临床妊娠率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。短时受精不影响常规受精率是因为卵丘细胞中的某些成分不仅可以促进精子获能和顶体反应,还会降低多精受精比例,例如,卵丘细胞团含有大量的透明质酸,会降低多精受精的发生率［12］。在短时受精过程中早期去除卵细胞会使卵母细胞与周围的卵巢细胞及其分泌因子分离,将微环境与卵细胞分离,并增加多精受精的可能性［13］。此外,卵子细胞的去除是一个机械过程,机械刺激可能会损害卵母细胞,尤其是透明带,例如卵母细胞。虽然短期受精增加了多精受精率,但不影响整体正常受精率。多原核受精是一种异常受精现象,体外受精造成的多核受精的胚胎一般是多倍体,不能用于移植,导致胚胎和卵子资源大量流失［14］。许多因素是多核受精的起源,主要与女性的卵母细胞成熟度和男性的精子质量有关［15］。研究表明,短期受精可以降低多核受精率［16］。本研究发现短时组多原核受精率略低于常规组,但差异无统计学意义(P＞0.05),说明短时受精并不能有效降低多原核受精率。

综上所述,不孕患者在IVF 过程中短时受精的优质胚胎率由于缩短精卵孵育时间,在一定程度上能提高胚胎质量,短时受精可以在不影响正常受精率的前提下为临床提供更多的优质胚胎,可在临床推广使用。