任倩 李春苗 刘兴莉

ABO血型系统是最重要且最复杂的血型系统之一，与临床输血、器官移植等存在紧密联系。随着分子生物学的发展，ABO血型及亚型的基因序列不断被人们认识。目前已知的ABO亚型多由编码区的基因变异引起，如6、7外显子碱基突变、缺失、插入、替换等，均可影响A或B糖基转移酶的活性，从而导致ABO表型的变化[1]。除外显子外，内含子、5'-和3'-非编码区等也会影响转录效率[2]。因此，ABO基因序列变异的分析对准确报告ABO表型以及为临床输血提供有用的信息都至关重要。本研究通过血清学方法对家系成员ABO血型进行鉴定，然后通过聚合酶链反应（PCR）对ABO基因序列进行测定，研究其分子基础并进行家系分析。

资料与方法

1 对象 先证者，女，5岁7月，因腺样体肥大入院，输血前检查发现ABO血型正定型A抗原反应正常、B抗原反应弱，术前无输血史，同时采集其父母血液样本进行家系分析，家系成员均签署了知情同意书。

2 试剂与仪器 抗-A、抗-B血型定型试剂（单克隆抗体）（批号20210913）购自上海血液生物医药有限公司,抗A1试剂（批号20211028）和抗A，B（批号20211208）均购自江苏中济万泰生物医药有限公司，抗-H试剂（批号8000258203）购自荷兰Sanquin公司，抗D（IgM）（批号20191811）、人ABO血型反定型用红细胞试剂盒（批号20215309）购自上海血液生物医药有限公司，ABO正反定型血型卡（批号20210603）购自长春博迅生物技术有限公司，人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒（荧光PCR法）、全血DNA提取试剂盒均购自江苏中济万泰生物医药有限公司。Hamilton全自动血型分析仪（型号Microlab Starlet IVD）购自长春博迅生物技术有限公司，荧光定量PCR仪（型号FQD-96A）购自杭州博日科技股份有限公司。

3 方法

3.1 血清学分型：抽取先证者及家长各2～3mL静脉血，EDTA抗凝，采用经典试管法进行正反定型。血清学血型分型方法和操作步骤参照《全国临床检验操作规程》。

3.2 DNA提取与扩增：用全血DNA提取试剂盒（江苏中济万泰生物医药有限公司）提取基因组DNA。PCR扩增目的基因，产物经回收纯化用于基因分型及序列测定。

3.3 荧光PCR法基因分型：用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒（荧光PCR法）（江苏中济万泰生物医药有限公司）进行基因分型。

3.4 序列测定：测序试剂盒购自江苏中济万泰生物医药有限公司，对ABO基因第1-7外显子和启动子5'UTR区进行序列测定。ABO基因参考序

列为ABO*A1.01.01等位基因序列（GenBank：AJ536122）。引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物序列

结 果

1 血清学定型结果 血型血清学结果见表2。正定型，先证者红细胞与抗A发生强凝集（4+），与抗B发生混合凝集（MF），与抗A，B发生强凝集（4＋），与抗H发生强凝集（3+W）；反定型，先证者血清不与A细胞、B细胞凝集。其母亲红细胞与抗B发生强凝集（4+），与抗A，B发生强凝集（4＋），与抗H发生强凝集（4+）；反定型，血清与A细胞发生凝集（2+）；血清中无不规则抗体的存在。先证者父亲为正常的AB型血反应格局。

表2 先证者及其家族成员ABO血型血清学结果

2 血型基因荧光分型 根据ABO基因分型结果，先证者荧光分型为A/B，先证者父亲荧光分型为A/B，先证者母亲荧光分型为B/O。荧光PCR分型结果见图1。

图1 先证者及其父母荧光分型结果

3 基因测序结果及变异分析 先证者基因型为ABO*A1.02/B311，先证者母亲基因型为B311/ABO*O.01.01。DNA序列分析显示，与ABO*B.01相比，B311存在启动子5'UTR区-35到-18缺失（图2）；先证者的父亲基因分型的测序结果显示具有ABO*A1.02和ABO*B.01的碱基特征。先证者及其家族成员ABO基因克隆测序结果见表3。

表3 先证者及其家族成员ABO基因测序结果

4 家系分析 根据ABO血型基因第1-7外显子及启动子5'UTR区测序结果显示，先证者基因型为ABO*A1.02/B311，先证者母亲基因型为B311/ABO*O.01.01，先证者父亲基因型为ABO*A1.02/ABO*B.01。（图3）。

图2 启动子5'UTR区克隆测序结果

图3 先证者及其家族成员家系分析

讨 论

ABO血型系统与临床输血有着密切的联系，血型鉴定的正确与否是临床安全输血的关键所在，实际工作中，经常会遇到血型正反定型不符或者抗原、抗体减弱等情况，除年龄、疾病等因素外，多数为ABO基因变异导致的亚型或变异型。随着分子生物学的发展，ABO血型及亚型的基因序列不断为我们所认识[3]。本研究中先证者血型正定型A抗原反应正常、B抗原反应弱，为进一步确定患者血型及抗原减弱原因测定了ABO基因序列并进行了家系分析。

根据ABO血型血清学特征将A亚型分为A2、A3、Ax、Am、Ael、Aend、Ay等，Salmon依照A亚型的分类标准将B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel、Bw[1]。WIENER等于1972年报道了首例非分泌B3，被认为是最稀少的一种B亚型[4]，在中国汉族人中的比例约为1/900（B型），AB3型在中国汉族人中比例为1/1 800（AB型）[5]。目前NCBI中登记的B3亚型有16种[6]，其中，B311亚型最早于2013年在中国上海发现[2]，迄今共有4例AB311和5例B311报告[7-9]。B3亚型最主要的血清学表现是正定型抗B抗体呈现混合视野外观（MF），抗H抗体呈现强凝集；反定型多数没有抗B，仅少数存在冷反应性抗B[10]。

本研究中先证者及其母亲，试管法与抗H血清凝集分别为3+W、4+，呈现出与报道中B311亚型抗H强凝集相同的表现[9]。先证者基因测序结果为AB311，其红细胞与抗A血清凝集为4+，与抗B血清呈混合凝集外观；但其母亲测序结果为B311，红细胞与抗B血清为强凝集4+，与报道的B311抗B抗体呈现混合视野外观的血清学表现（MF）描述不符[10]。 这可能与年龄和生长发育特点相关，研究显示，由于2型前体物质不成熟，脐带血红细胞ABO抗原数量比成人低[11]，新生儿红细胞所带的抗原数目只有成人的25%～50%，且抗原发育不成熟[12]，随着年龄增长，更多的A抗原或B抗原得以表达[13]，2～4岁时表达水平与成人相同[11]。丹尼尔在《人类血型》[14]论著里提到，由于等位基因的竞争作用，两种不同的糖基转移酶会竞争共同受体物质，使得A2B细胞上的A抗原比A2细胞上的A抗原弱，A1B细胞上的A抗原比A1细胞上的A抗原弱，这可能是导致本研究中先证者与其母亲虽同时具有B311等位基因，但血清学表现并不一致的原因。张韦等[15]的研究中指出，日常使用的单克隆抗体效价很高，增加了与细胞的反应强度，使得部分凝集强度稍弱的亚型标本漏检，而与人源血清反应明显减弱，本研究使用的血清抗体为单克隆抗体，也可能是引起母亲血清学表现正常的原因。同时也提示我们，今后的工作中，对于疑难血型，应增加人源血清学实验，以提高亚型检出率。

已知ABO亚型多由编码区的基因突变引起，如发生在第6、7外显子的碱基突变、替换、插入、缺失和杂交等位基因等，可能影响A或B糖基转移酶的活性，进而引起ABO表型的变化[16]。除了外显子的变化，第一个内含子及5'-和3'-非编码区的ABO基因的特异性调控元也被发现能影响转录效率，从而影响ABO基因产物，导致ABO亚型的产生[17-18]。本研究中B311亚型即发生在基因启动子上游5'UTR区，在该区域检测出-35到-18碱基的缺失，与2013年上海报道的首例B311亚型碱基序列一致。研究证明，启动子的突变可能会影响转录因子与启动子的结合，从而影响启动子的转录活性[19-20]。蔡晓红等研究发现，-35到-18碱基的缺失，导致了启动子活性降低了50%以上，可能影响了RNA聚合酶Ⅱ或其他转录因子与启动子结合的能力[9]，从而导致了B311亚型红细胞表面抗原的弱表达，与本研究先证者的血清学结果相符。

有研究提出，先心病等疾病可能会导致ABO血型抗原的弱表达[21]。为了探究先证者抗原表达弱是否与疾病相关，我们对其父母ABO血型基因第1-7外显子及启动子5'UTR区进行了序列测定，通过家系分析发现，先证者B311等位基因应来自于其母亲，其抗原表达弱可能与B311等位基因相关，与本身所患腺样体肥大可能没有关系。

ABO亚型患者很难找到同型血液，一般输注时红细胞尽量选择O型洗涤红细胞，血浆或冷沉淀选择AB型或亚型对应的正常血型，血小板选择亚型对应的正常血型。由于B3型血浆中通常不含抗-B，输血也可采用B型相容性输血。因此，一般情况下为保证临床用血安全可采用O型洗涤红细胞；如若患者病情危重且无抗B抗体存在，也可考虑B型红细胞。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突