＊廖凌姗 田圣 陈杰 熊竹 黄辉胜 袁斌芳

（长江师范学院化学化工学院 重庆 408100）

现代社会，随着生活水平的大幅提升，人们比以往更加重视身体健康。大量研究表明，花青素具有抗氧化、延缓衰老、改善视力、防癌抗癌等功效，近年来备受关注[1]。然而，花青素价格普遍较高，受益人群小。胭脂萝卜种植面积大，花青素含量高，提取工艺成熟，因此，胭脂萝卜花青素成本低廉，售价相对较低，深受消费者青睐，市场潜力巨大。与其他来源的花青素一样，胭脂萝卜花青素也属于类黄酮物质，其基本结构为2-苯基苯并吡喃酮型阳离子，以C6-C3-C6为骨架，稳定性不高，在各种物理、化学因素的影响下化学结构易发生改变而变质[2]。本文以乙醇水溶液为提取液从胭脂萝卜中分离出花青素，研究了自然光、温度、pH、金属离子等因素对其稳定性的影响，同时考查了其抗氧化性能。

1.实验材料与方法

(1)材料与试剂

胭脂萝卜、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品、ABTS、DPPH、过氧化氢、过硫酸钾、抗坏血酸、硫酸亚铁、溴甲酚紫、氟化钠、磷酸氢二钠、无水柠檬酸、盐酸、氢氧化钠、乙醇。

(2)仪器与设备

PT3502C型酶标仪、U-3010型紫外-可见分光光度计、RE-3000A型旋转蒸发仪、LGJ-12型冷冻干燥机、PHS-3E型pH计、PTX-FA1205型全自动电子天平、Eurostar 20型机械搅拌器、HH-WO-5L型恒温水浴锅、BPG-9056A型鼓风干燥箱、DZF-6020型真空干燥箱、2XZ-2型旋片式真空泵。

(3)实验方法

①胭脂萝卜花青素的提取

将胭脂萝卜切块并打成浆状，倾入层析柱中，加入体积比6:4的乙醇水溶液，静置1h，打开活塞收集流出液，旋转蒸发除去乙醇，-55℃冷冻干燥，得到胭脂萝卜花青素粉末。

②胭脂萝卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的测定[3-4]

采用标准曲线法测定胭脂萝卜花青素中的主要成分天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。先将天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准品配制成不同质量浓度的稀释液，调节pH至3.0，测试吸光度；再配制不同质量浓度的胭脂萝卜花青素稀释液，调节pH至3.0，测试吸光度；以系列质量浓度梯度稀释液最大吸收峰处（513nm）的吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制散点，并线性拟合成直线，得到标准直线；在标准直线上找出花青素稀释液最大吸收峰处的吸光度所对应的标准品质量浓度，并根据花青素稀释液，按公式（1）计算花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。

式中，Cs为标准品质量浓度，mg/L；V为稀释后花青素的体积，L；m为称取的花青素质量，g。

③胭脂萝卜花青素的稳定性研究[5]

A.自然光的影响。取10mL花青素样液于比色管中，放于自然光照射处，每隔5～10天测定一次吸光度，连续测30天。B.温度的影响。将10mL花青素样液转移至具塞试管中，分别于50℃、70℃、90℃下加热1h、2h、3h、4h，测定吸光度。C.pH值的影响。利用柠檬酸、磷酸氢二钠调节花青素样液pH为2.0、4.0、6.0、8.0，于50℃下水浴加热1h、2h、3h、4h，测定吸光度。D.金属离子的影响。量取10mL花青素样液于4支具塞试管中，分别加入1mmol/L的Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+，调节pH至3.0，在50℃下加热，加热1h、2h、3h、4h，测定吸光度。

④胭脂萝卜花青素的抗氧化活性研究[6]

A.ABTS•+清除能力的测定

将7mmol/L的ABTS水溶液和12.25mmol/L的K2S2O8水溶液按体积比5:1混合，避光放置12h得ABTS•+溶液。用无水乙醇稀释ABTS•+溶液至吸光度为0.7左右，作为工作液。将50μL样液1000μL工作液混合，在室温下避光保存7min，转移至ELISA板。对照组用抗坏血酸水溶液代替样品。ABTS•+的特征吸收波长在734nm处，测定吸光度。ABTS•+清除率（SA）按公式（2）进行计算。

式中，Ac为50μL无水乙醇加入1000μL ABTS•+工作液的吸光度；As为50μL样液加入1000μL ABTS•+工作液的吸光度。

B.DPPH•清除能力的测定

移取200μL样液于一具塞试管中，加入现配等体积的0.6mmol/L DPPH•乙醇溶液，避光存放30min，引入ELISA板。对照组用抗坏血酸水溶液代替样品。DPPH•的特征吸收波长在517nm处，测定吸光度。DPPH•清除率（SA）按照公式（3）进行计算。

式中，Ac为200μL无水乙醇与200μL DPPH•的吸光度；As为200μL样液的吸光度。

C.OH•清除能力的测定

将0.4mL 0.5g/L溴甲酚紫乙醇溶液、将0.5mL 0.1mol/L盐酸溶液、1.0mL 5mmol/L FeSO4溶液、0.5mL H2O2溶液依次倾入10mL具塞试管中，摇匀，稀释至刻度，置于30℃水浴中反应8min，取出后立即加入0.2mL 0.1% NaF溶液终止反应。对照组用抗坏血酸水溶液代替样品。OH•的特征吸收波长在420nm处，测定吸光度。OH•清除率（SA）按照公式（4）进行计算。

式中，As为反应液与待测样品混合后的吸光度；A为反应液的吸光度；A0为溴甲酚紫、盐酸混合液的吸光度。

2.结果与讨论

(1)胭脂萝卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的测定

对pH3.0的样液进行全波段扫描，得到可见光吸收光谱，如图1所示。最大吸收峰出现在513nm处，峰值为0.909。花青素粉质量为0.05g，稀释后体积为100mL。根据标准直线（图2）和公式（1）计算出花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量为26.8%。

图1 pH3.0胭脂萝卜花青素可见光吸收光谱

图2 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷标准直线

(2)胭脂萝卜花青素稳定性研究

①自然光的影响。室温环境中，自然光照下暴露30天，样液中的花青素不断降解，吸光度随之发生改变，变化趋势如图3所示。从图3可以看出样液的吸光度随着时间的推移逐渐下降，30天后下降了69.7%。说明花青素对自然光非常敏感，长期储存需要密封、避光。

图3 自然光对胭脂萝卜花青素的影响

②温度的影响。花青素的稳定性与温度及加热时间的关系如图4所示。结果显示，花青素受温度影响较大，相同的加热时间，加热温度为90℃时，花青素的降解率最高，加热温度为50℃时，花青素的降解率最低；加热温度为70℃时，花青素降解速率最小；相同加热温度下，加热时间越长，花青素降解率越高。在90℃下加热4h，降解率达47.3%；在70℃下加热4h，降解率为39.9%，在50℃下加热4h，降解率为38.6%。

图4 温度对胭脂萝卜花青素的影响

③pH值的影响。将花青素样液的pH值分别调至2.0、4.0、6.0和8.0，测试其吸光度，发现pH值为6.0和8.0时，最大吸收峰的位置移动到了532nm和580nm处，说明花青素的化学结构发生了改变。图5为花青素在50℃下pH值为2.0和4.0的酸性环境中加热，吸光度随时间的变化曲线。加热4h后，pH值为2.0和4.0的样液的吸光度分别下降了4.7%和27.2%。结果显示，花青素在碱性环境中极不稳定，在酸性较强的环境下稳定性较高，应存放在酸性环境中。

图5 pH值对胭脂萝卜花青素的影响

④金属离子的影响。在pH3.0的样液中加入1mmol/L的金属离子，50℃下加热4h，间隔1h测试一次吸光度。金属离子对花青素稳定性的影响趋势如图6所示。显然，不同的金属离子对花青素稳定性的影响有一定的差异，Zn2+和Mg2+能提高花青素的稳定性；含Ca2+的样液的吸光度变化曲线与花青素样液的吸光度变化曲线重合，表明Ca2+的存在对花青素的稳定性几乎没有影响；而Fe2+则会促进花青素的降解，导致其降解速度加快。

图6 金属离子对胭脂萝卜花青素的影响

(3)胭脂萝卜花青素抗氧化活性研究

①ABTS•+清除能力的测定。利用ABTS与K2S2O8反应生成蓝绿色的ABTS•+，加入具有抗氧化活性的样品，ABTS•+质量浓度降低，溶液颜色变浅，吸光度发生改变。图7是不同质量浓度的花青素和抗坏血酸清除ABTS•+曲线。花青素清除ABTS•+的IC50为25mg/L，抗坏血酸为21mg/L，且在低质量浓度范围内，花青素清除ABTS•+的能力高于抗坏血酸，说明两者清除ABTS•+的能力差异不大。

图7 不同浓度的胭脂萝卜花青素和抗坏血酸清除ABTS•+曲线

②DPPH•清除能力的测定。DPPH•在有机溶剂中能稳定存在，其乙醇溶液为深紫色，将抗氧化活性物质颜色变浅，吸光度产生变化。图8为不同质量浓度的花青素和抗坏血酸清除DPPH•曲线。花青素清除DPPH•的IC50为9mg/L，抗坏血酸为9.5mg/L；在低质量浓度区间，花青素清除DPPH•的能力稍高于抗坏血酸，在高质量浓度区间，抗坏血酸清除DPPH•的能力高于花青素；花青素对DPPH•有较强的清除能力，质量浓度为25mg/L时，DPPH•清除率达86.0%。

图8 不同浓度的胭脂萝卜花青素和抗坏血酸清除DPPH•曲线

③OH•清除能力的测定。双氧水与硫酸亚铁反应生成OH•，遇溴甲酚紫显黄色，添加抗氧化活性物质，颜色变淡，吸光度发生变化。图9为不同质量浓度的花青素和抗坏血酸清除OH•曲线。花青素清除OH•的IC50为12mg/L，抗坏血酸为17mg/L；在整个质量浓度区间，花青素清除OH•的能力均高于抗坏血酸；花青素对OH•有较强的清除能力，质量浓度为25mg/L时，OH•清除率达81.3%。

图9 不同质量浓度的胭脂萝卜花青素和抗坏血酸清除OH•曲线

3.结论

胭脂萝卜花青素的稳定性受自然光影响较大，在自然光照下室温存放30天后吸光度下降了69.7%。花青素的稳定性受温度影响较大，热稳定性不够高，在90℃下加热4h，降解率达47.3%。花青素在碱性环境中化学结构易发生改变，在酸性较强的环境下稳定性较高，应存放在酸性环境中。Zn2+和Mg2+能提高花青素的稳定性，Ca2+对花青素的稳定性几乎没有影响，Fe2+会引起花青素加速降解。花青素的体外抗氧化活性较高，表现出较强的自由基清除能力，对于ABTS•+、DPPH•、OH•的IC50分别为25mg/L、9mg/L、12mg/L，与抗坏血酸相当。