韩 智 沈越利 荀运浩

1.浙江中医药大学研究生院第四临床医学院 (浙江 杭州， 310013) 2.桐乡市第一人民医院 3.杭州市西溪医院

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种异位脂质积聚的形式，来源于由构成三个脂肪酸分子的甘油分子组成的甘油三酯(TGs)在肝脏重量的5%或以上积聚，没有过量的酒精摄入(<20 g/d)[1]，已成为全世界儿童和成人最常见的慢性肝病[2]。在过去30年里，由于全球范围内代谢紊乱的流行，NAFLD全球患病率急剧上升，中国患病率为15%～30%[3]。重要的是，持续性脂肪肝将单纯性肝脂肪变性转化为脂肪性肝炎(NASH)，其特征是同时存在炎症和肝细胞损伤。此外，NAFLD发展为纤维化，最终发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)[4]。因此全面探索和阐述NAFLD风险因素和相关发病机制，进行针对性的早期预防和诊断就显得尤为重要。

有研究表明，轮班工作和熬夜等行为扰乱人体固有的、规律的昼夜节律，增加了NAFLD发病风险[5,6]，提示生物节律干涉可能是一种有效策略。昼夜节律作为最普遍存在的生物节律形式，是指生命活动以24 h为周期的震荡，以确保机体生理功能在一天中的正确时间发生[7]。昼夜节律由下丘脑视交叉上核(SCN)的中央振荡器和几乎所有的外周组织(肝脏、肺、骨骼肌)的外周振荡器组成[2]。SCN通过接收来自视网膜的直接光照反应，使机体内部与外环境的24 h节律同步，并通过神经、激素、体温及行为信息等将其固有的定时信号发送至外周振荡器，以协调全身所有器官和细胞的分子节律[8]。就NAFLD而言，越来越多研究表明，生物节律与代谢性疾病密切相关，可参与脂质、葡萄糖和胆固醇等代谢[9]。因此，了解生物节律在机体内对肝脏的调节机制，阐明昼夜节律紊乱(CRD)如何影响NAFLD的发病显得尤为重要。本文就当前昼夜节律在NAFLD发生、发展及相关肝外疾病中的作用进行系统综述，为今后NAFLD的综合防治提供新思路。

1 昼夜节律参与NAFLD的证据及机制

横断面研究表明睡眠剥夺和NAFLD之间存在联系，有不同的研究发现被报道。2011年对大约日本8 000名男性政府雇员观察发现，在睡眠时间短(少于5 h)的患者中，NAFLD患病率较高，而在调整年龄和睡眠质量后，睡眠时间超过7 h的患者患NAFLD风险降低(OR=0.82)[10]。在一项针对约45 000名成年人的韩国大型研究中，睡眠时间短(少于5 h)与成年人患NAFLD的风险增加有关，然而当调整体重指数时，这种关联仅在女性中显著[11]。动物研究已经将昼夜节律时钟基因与NAFLD的发病机制联系起来。这是公认的当喂食高脂肪食物(HFD)时，野生型小鼠变得肥胖，获得胰岛素抵抗，并发生肝脂肪变性[12]。系统敲除Clock基因的小鼠在喂食标准饮食时出现类似的代谢特征和肝脏脂肪变性，并且当给它们给予HFD时，它们表现出甚至更严重的表型。这些发现表明，时钟基因在代谢稳态中起着关键作用，并对NAFLD的发展具有潜在的保护作用[13]。除了敲除模型研究之外，还在小鼠模型中研究了CRD，方法是让它们在一周的早期提前进入光阶段，然后在一周的中期推迟进入光阶段。在慢性时差反应条件下，野生型小鼠产生了胰岛素抵抗、肥胖、高体脂、肝甘油三酯和游离脂肪酸增加的肝肿大、慢性肝脏炎症和纤维化。因此，时差引起的CRD不仅导致脂肪变性，还导致伴有纤维化的NASH[14,15]，表明时钟基因和NAFLD之间有很强的相关性，有证据表明昼夜节律的破坏导致了NAFLD的整个病程[16]。

2 昼夜节律参与NAFLD进展的机制

NAFLD患者有发展为纤维化和肝硬化的风险，肝硬化患者患有门静脉高压症和昼夜节律系统功能失调，其特征是睡眠-觉醒周期延迟、循环褪黑激素和皮质醇变化以及日间嗜睡，此外，肝硬化患者还有异常的昼夜纤溶节律、静脉曲张出血、肝脏褪黑激素代谢和动脉血压[17]。四氯化碳诱导的急性肝纤维化小鼠表现出Cry2、Ppara和Ror的异常表达节律[18]。与野生型对照组相比，注射四氯化碳后，全局敲除Per2导致更严重的肝纤维化[19]。经四氯化碳处理激活的肝星状细胞发生转分化为成纤维肌成纤维细胞样细胞，导致肝纤维化和肝硬化。核受体如PPARγ和REV-ERBα的激活抑制活化的肝星状细胞[20]。肝硬化也可能是由胆汁酸在肝脏中的积聚引起的，这一过程称为胆汁淤积。Per1和Per2双基因敲除小鼠的血清和肝胆汁酸水平升高，肝脏胆汁淤积[21]。因此，肝纤维化、肝硬化和昼夜节律钟系统之间发生了强有力的相互作用，表明昼夜节律钟可能是治疗目标。

NADLD患者也可能最终演变为HCC，而由生物钟机制调节的昼夜节律在包括HCC在内的不同长期疾病中起着重要作用。肝癌的发生与管理基本细胞过程的机制持续失效有关，例如细胞周期、增殖、分化、凋亡、DNA损伤反应、自噬、异生素解毒、合成代谢/分解代谢过程以及具有活性氧产生/抗氧化防御平衡的氧化还原反应，上述生物过程和信号通路的大部分以节律性活动波动为特征，周期约为24 h(昼夜节律)[22]。据报道，褪黑激素可以缓解HCC的发展和恶化。在二乙基亚硝胺(DEN)诱导HCC小鼠的研究中，在给予DEN后，Bmal1、Clock、Npas2、Rorα和Sirt1的肝脏表达增加，而Cry1、Per1、Per2、Per3、CK1ε、Rev-erα和Rev-erβ的表达减少，而褪黑激素治疗阻止时钟基因表达的变化。在褪黑激素处理的小鼠中也观察到p21、p53和PARP1/2表达增加，Bax/Bcl-2比率升高，细胞周期蛋白D1、CDK6、HSP70、HSP90和GRP78蛋白表达降低[23]，表明昼夜节律时钟的调节可能有助于褪黑激素对癌症进展的调节。

3 昼夜节律参与肝外疾病的证据及机制

3.1 糖尿病 中枢时钟调节食物摄入、能量消耗和全身胰岛素敏感性，而这些行为又被局部外周时钟进一步微调。例如，肠道的外周时钟调节葡萄糖吸收，肌肉、脂肪组织和肝脏的外周时钟调节局部胰岛素敏感性，胰腺的外周时钟调节胰岛素分泌[7]。肝脏是负责每日葡萄糖稳态昼夜节律控制的主要器官之一[24]，在禁食条件下，肝脏葡萄糖产生速率的昼夜波动决定了血糖的昼夜变化。肝脏也有助于餐后葡萄糖代谢的昼夜控制，因为肝脏葡萄糖产生速率的昼夜变化也是胰岛素敏感性和餐后耐受性昼夜周期的关键决定因素。此外，肝糖生成的关键代谢和酶促决定因素(即糖异生、糖原分解和糖原储存的速率)在人类和各种动物模型中都显示出强大的昼夜节律变化[25]。研究发现：与没有轮班工作经验的人相比，从事轮班工作的人患糖尿病的风险增加了9%，这是根据一项使用护士健康队列的纵向研究，这种风险也与轮班工作的持续时间呈正相关，轮班工作每5年风险增加5%[26]，这些发现共同表明昼夜节律紊乱增加了Ⅱ型糖尿病的风险。

3.2 乳腺癌 乳腺癌是世界上最常见的癌症类型，国际癌症研究机构(IARC)根据8项流行病学研究和动物模型数据，将CRD归类为可能的人类致癌因素[27]，被假设为夜间与光相关的CRD，通过降低褪黑激素水平来起作用。褪黑激素抑制雌激素的产生，起抗氧化剂的作用，对乳腺癌细胞有凋亡和抗增殖作用。其他潜在的机制包括氧化应激和由CRD引起的慢性炎症[28]。流行病学研究的2项荟萃分析表明，轮班工作和局域网暴露与女性乳腺癌风险轻度升高相关，估计癌症风险分别增加19%、12%。生物分子钟由几个基因组成，形成自动调节的转录和翻译反馈环，这些基因可能直接或间接参与细胞周期停滞、脱氧核糖核酸损伤修复、细胞增殖、维持基因组稳定性、炎症、氧化应激和凋亡等关键的分子过程，从而在致癌过程中发挥关键作用[29]。中枢昼夜节律系统通过下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)和激素受体的表达对生殖激素的合成和释放发挥多重调节作用。有证据表明雌激素受体α的表达直接受核心时钟基因Per2的调节，雌激素受体α在健康和癌症乳腺细胞中的转录能力表现出周期性。乳腺癌细胞中Per1、Per2和Per3基因的去调控也被检测到[30]。因此，CRD与乳腺癌的发生密切相关。

3.3 结直肠癌 多项研究将时钟基因的表达与临床结果联系起来，Mazzoccoli等[32]证明，与健康结肠黏膜相比，结直肠癌组织中Per1、Per2、Per3和CRY2表达显著下调，而Per1和Per3表达较低与存活率较低有关。这些基因主要作为肿瘤抑制剂，它们的下调与结直肠癌的发展和进展有关。在另一项研究中，发现分化良好的癌细胞的Per2水平与非癌细胞相当，这表明Per2的丢失与结直肠癌的侵袭性增加有关[31]。在结直肠恶性肿瘤中，昼夜节律基因和蛋白质发生变化，并影响结肠癌细胞的表型特征、疾病进展、患者存活率和对化疗的反应，因此昼夜节律是可能的治疗靶点。

4 小结与展望

随着轮班和慢行时差的不断增加，CRD已经成为现代生活方式的重要组成部分。目前，越来越多的证据表明，CRD对NAFLD的发生具有重要作用。随着对昼夜节律的进一步研究，逐渐认识到昼夜节律在NAFLD的基础上进一步发展为肝硬化、HCC过程中及在肝外代谢性疾病包括糖尿病、乳腺癌、结直肠癌等疾病的重要性。然而，CRD在NAFLD的具体影响机制尚不清楚，在今后工作中，在广泛的流行病学、临床医学和动物实验研究的基础上，相信对昼夜节律与NAFLD的深入研究，终能发现NAFLD与昼夜节律的相关因果关系，制定出预防及治疗新策略。