李晶津 王佳玉 金泽宁

首都医科大学附属北京天坛医院 (北京， 100070)

肝脏是胆固醇代谢的重要器官，而胆固醇的水平是影响动脉粥样硬化疾病的重要因素，临床上治疗动脉粥样硬化的基石药物他汀类药物，通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，抑制肝脏合成胆固醇[1]。昼夜节律系统是一种进化上保守的计时机制，控制哺乳动物每日的行为和生理节律，使之与外环境计时同步，以确保机体保持最佳的适应能力[2]。脏器的时钟节律由转录激活因子(CLOCK/BMAL1)和抑制因子(PER/CRY)组成的转录/翻译负反馈环驱动，并调节参与关键细胞功能的基因的节律性表达[3，4]。有研究报道，昼夜节律与肝脏相关脂代谢密切相关，CLOCK可节律性调控肝脏中甘油三酯水平 ，肝脏中敲除BMAL1后表现出能量代谢的紊乱及氧化损伤的累积[5，6]。本研究旨在通过生物信息的分析，研究昼夜节律对肝脏胆固醇代谢的影响，探讨昼夜节律通过胆固醇代谢调节动脉粥样硬化的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 通过GEO数据库搜索关键字“昼夜节律”“小鼠”“肝脏组织”“饮食干预”“昼夜节律基因调节”获取相关研究样本数据。GSE52333检测样本数36(高脂饮食小鼠vs正常饮食小鼠)[7]，GSE70497检测样本数24(昼夜节律基因Artnl敲除型小鼠vs野生型小鼠)[8]。

1.2 生物信息学分析 利用CirGRDB获得具有昼夜节律的基因表达谱[9]，利用KEGG数据库检索胆固醇代谢通路相关基因[10]，筛选出具有节律性的肝脏胆固醇代谢相关基因。

1.3 统计学方法 基因表达谱数据采用GraphPad Prism 5.0.1软件处理，结果以均数± 标准差表示。利用Lomb-Scargle 周期表算法预测时间序列的周期性(LSPR)分析方法获得相关基因的昼夜节律显著性(P值)、昼夜节律振幅(amplitude)、昼夜节律时相(即节律的波峰点，phase)[11]。

2 结果

2.1 小鼠肝脏昼夜节律表达基因谱分析 通过生物信息学分析两组芯片数据，发现高脂饮食小鼠肝脏中具有昼夜节律的基因有3 337个，昼夜节律基因Artnl敲除型小鼠肝脏中具有昼夜节律的基因有1 832个。KEGG数据库中胆固醇代谢通路涉及49个基因，通过韦恩图分析，上述具有昼夜节律的基因中有8个基因参与胆固醇代谢通路。见图1。

图1 肝脏组织中昼夜节律表达的胆固醇代谢相关基因筛选

2.2 小鼠肝脏中昼夜节律表达的胆固醇代谢相关基因分析 小鼠肝脏中昼夜节律表达的胆固醇代谢相关基因包括内皮脂肪酶(LIPG)、中性胆固醇水解酶1(NCEH1)、人血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)、尼曼-匹克C1型蛋白(NPC1)、ATP结合盒蛋白B11(ABCB11)、ATP结合盒蛋白G5(ABCG5)、ATP结合盒蛋白G8(ABCG8)，在胆固醇代谢通路中的主要功能包括胆固醇合成、胆固醇排泄、胆汁酸排泄、抑制脂蛋白脂解酶。振幅、时相、P值等昼夜节律数据见表1。

表1 小鼠肝脏中胆固醇代谢相关基因的昼夜节律数据

2.3 小鼠肝脏中胆固醇代谢相关基因昼夜节律表达特征 通过分析上述胆固醇代谢相关基因的节律性，发现其昼夜表达特征。正常饮食小鼠肝脏中LIPG、NCEH1、ANGPTL4、NPC1、ABCG5、ABCG8的表达量在光周期下逐渐增加、中午达到峰值，随后在暗周期下逐渐降低；LIPA、ABCB11的表达量则在光周期下逐渐减少，中午降至最低，随后在暗周期下逐渐增多。与之相比，高脂饮食可增加相关基因的表达量，但不影响昼夜节律性，见图2。芳基烃受体核易位样蛋白1(Artnl)也被称为BMAL1，是昼夜节律系统的重要调节因子，敲除Artnl基因后，小鼠肝脏胆固醇代谢基因表达的昼夜节律消失，见图3。

图2 小鼠肝脏中胆固醇代谢相关基因昼夜节律表达特征 (·为正常饮食组，■为高脂饮食组)

图3 Arntl基因敲除小鼠肝脏中胆固醇代谢基因的昼夜表达节律消失 (·为野生型组，■为Arntl基因敲除组)

3 讨论

胆固醇既是细胞生物膜的构成成分，又是类固醇类激素、胆汁酸及维生素D的前体物质，胆固醇代谢失调能够引起多种疾病，血浆胆固醇水平增高是引起动脉粥样硬化的主要因素，可引起一系列心血管疾病。肝脏是胆固醇合成的主要场所，也是将胆固醇转化为胆汁酸的主要器官，在胆固醇的代谢过程中起到重要作用。肝脏是所有类型脂质的主要代谢器官，主要通过调节脂蛋白合成、脂质摄取和转化、脂肪酸的从头合成和氧化来参与脂质代谢过程。肝脏的代谢功能受昼夜节律的影响较大，现代生活昼夜节奏不规律，夜间熬夜现象严重，昼夜节律紊乱导致代谢综合征[12]，有报道昼夜节律控制因子敲出后导致胆固醇代谢紊乱[13]。小鼠肝脏中敲除REV-ERB-α和REV-ERB-β可调节脂代谢相关基因[14]，相关分子机制在肝脏起到调节昼夜节律的作用[15]。

本研究通过芯片数据挖掘和生物信息学分析，探索昼夜节律对肝脏胆固醇代谢的影响，发现小鼠肝脏部分胆固醇代谢相关基因表现出昼夜节律性，LIPG、NCEH1、ANGPTL4、NPC1、ABCG5、ABCG8的表达量在光周期下逐渐增加、中午达到峰值，随后在暗周期下逐渐降低；LIPA、ABCB11的表达量则在光周期下逐渐减少，中午降至最低，随后在暗周期下逐渐增多。整体的昼夜节律表现出与生理相关的昼夜节律特性，白天进食后，相关合成排泄的高峰较为集中，因此协调的昼夜节律能够保持相关胆固醇代谢的稳态，统一协调整个代谢过程。而敲除昼夜节律调节因子后，相关节律消失，整个代谢的过程无法根据机体的整体昼夜节律调节波峰波谷，从而影响胆固醇代谢。

LIPG在肝、肺、肾和胎盘中均可表达，是甘油三酯脂肪酶家族的成员，具有磷脂酶活性，参与高密度脂蛋白代谢，进而参与胆固醇逆向转运调控[16]。NCEH1主要分布在脂肪和肝脏细胞中，是一种重要丝氨酸水解酶，参与胆固醇脂、脂肪酸酯的水解代谢，在胆固醇逆向转运中发挥限速作用，在人类动脉粥样斑块区大量表达，也有研究报道NCEH1相关的脂质代谢异常与肝癌发生发展相关[17]。ANGPTL4属于分泌型糖蛋白，是血管生成素样蛋白家族成员，在肠道、脂肪、肌肉和肝脏等多种组织广泛表达，与动物脂肪代谢密切相关，主要通过抑制脂蛋白脂酶活性参与脂质代谢调控，具有促进脂解和脂肪酸氧化分解、减少脂肪沉积并刺激脂肪动用的作用[18]。LIPA又称酸性胆固醇酯水解酶，是脂蛋白代谢中的水解酶之一，早在20世纪60年代人们就发现，LIPA突变会导致多种组织内的脂质堆积。NPC1是一种胆固醇转运蛋白，NPC2能够从细胞内富含胆固醇的低密度脂蛋白中抽提胆固醇，然后传递给细胞膜上的NPC1，进而将胆固醇通过下游蛋白传递至细胞的其他部位[19]。ABCB11是ABC转运蛋白家族成员，其蛋白转运方式整合了底物浓度梯度扩散和ATP水解供能的主动运输，胆固醇在肝细胞中合成并代谢为胆汁酸盐，然后由ABCB11外排至胆小管，参与胆汁形成，帮助消化脂类和脂溶性维生素[20]。ABCG5和ABCG8都是依赖于ATP的跨膜转运蛋白ABC家族G亚家族成员，在小肠和肝脏高表达，二者在内质网装配为二聚体后转运定位于质膜顶端，促进胆固醇排泄至胆汁[21]。这些节律表达的胆固醇代谢相关基因与代谢相关疾病，如动脉粥样硬化有着紧密联系，ABCG5和ABCG8的高表达也能减少高血脂导致动脉粥样硬化[22]，NCEH1、ANGPTL4和NPC1敲出后均密切影响动脉粥样硬化的形成[23-25]。

研究结果提示，肝脏胆固醇代谢部分基因表达具有昼夜节律性，并在动脉粥样硬化病变过程起潜在作用。本研究也存在不足之处，昼夜节律影响肝脏胆固醇代谢的具体分子机制仍需进一步实验分析。