杜红丽，张晨宇，赵 清

［1河南中医药大学第五临床医学院（郑州人民医院）风湿免疫科，河南郑州450053；2河南大学淮河医院风湿免疫科，河南开封475099］

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜组织炎症、病理性血管大量生成、滑膜增生、关节软骨破坏及关节畸形为特征的慢性自身免疫性疾病，可导致关节功能丧失，严重影响人们的健康和生活质量［1-2］。目前尽管有多种药物可用于RA的治疗，包括糖皮质激素、非甾体抗炎药（雷公藤多苷）、甲氨蝶呤、抗B淋巴细胞药物及抗细胞因子等，但由于其副作用大或成本高，给患者带来巨大负担，延误疾病治疗［3-4］。因此，开发高效、低成本、副作用小的新型抗RA药物具有重要意义。黄芩素（baicalein，BA）是从黄芩中提取的黄酮类化合物，其具有抗炎和抗过敏的作用［5］。据报道，BA可抑制骨关节炎的进展［6］。而BA对RA大鼠炎症反应和病理性血管生成的影响尚未见报道。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路的激活对于病理性血管生成至关重要［7］。据报道，抑制HIF-1α/VEGF信号通路可减弱RA大鼠病理性血管生成［2］。而BA能否通过调控HIF-1α/VEGF信号通路影响RA大鼠炎症反应和病理性血管生成尚不可知。因此，本研究主要探究BA对RA大鼠的炎症反应和病理性血管生成的影响及其作用机制。

材料和方法

1 动物

72只体质量为310～330 g的8周龄SPF级雄性SD大鼠购自广州锐格生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK（粤）2021-0059。饲养于SPF级屏障环境，湿度控制在（55±5）%，温度为（24±2）℃，24 h昼夜灯光控制，自由摄食饮水。所有动物实验得到本院动物伦理委员会的批准。

2 主要试剂

BA（规格20 mg）购自北京普非生物科技有限公司；雷公藤多苷片（Tripterygium wilfordiipolyglycoside tablet，TWP；国药准字z34021048）购自宿州亿帆药业有限公司；HIF-1α激动剂二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）购自MedChemExpress；牛II型胶原蛋白购自上海联硕生物科技有限公司；完全弗氏佐剂乳剂购自上海瓦兰生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司；兔源VEGF、VEGF受体2（又称激酶插入域受体，kinase insert domain receptor，KDR）、HIF-1α和GAPDH抗体及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗兔Ⅱ抗均购自Abcam。

3 主要方法

3.1 动物分组及给药处理按照随机数字表法将72只大鼠分为对照（control）组、模型（model）组、低剂量BA（BA-L）组、高剂量BA（BA-H）组、TWP组和BAH+DMOG组，每组12只。除control组外，其它组大鼠均构建RA模型［8］。简言之，第1天通过右后足掌皮内注射0.1 mL II型胶原蛋白-完全弗氏佐剂乳剂对大鼠进行初次免疫，第7天通过尾根部再次注射同剂量造模剂对大鼠加强免疫。若大鼠出现后肢足趾红肿，踝关节体积增大，则为造模成功。第2次免疫24 h后开始给药处理：BA-L组［9］大鼠灌胃10 mg/kg BA且腹腔注射等体积的生理盐水；BA-H组［9］大鼠灌胃30 mg/kg BA且腹腔注射等体积的生理盐水；TWP组［10］大鼠灌胃6.25 mg/kg TWP且腹腔注射等体积的生理盐水；BA-H+DMOG组［11］大鼠灌胃30 mg/kg BA且腹腔注射40 mg/kg DMOG；control组和model组大鼠灌胃等体积的生理盐水且腹腔注射等体积的生理盐水。每天给药一次，持续4周。

3.2 标本收集第2次免疫（给药第0天）开始，每隔7 d测量大鼠足趾肿胀度和关节炎指数的变化；检测结束后，处死大鼠，每组选取4只大鼠，收集大鼠脾脏和胸腺组织用于脾脏和胸腺指数的检测；每组选取4只大鼠，收集大鼠踝关节滑膜组织，用于HE染色及免疫组化实验；每组取剩余的4只大鼠，收集大鼠踝关节滑膜组织，用于ELISA和Western blot。

3.3 足趾肿胀度的检测采用水容积法，从第2次免疫（给药第0天）开始，每隔7天测量大鼠右后足容积，即为大鼠足趾肿胀度。

3.4 关节炎指数的检测第2次免疫（给药第0天）开始，采取5级评分法［12］每隔7 d测量大鼠关节炎指数的变化：0分为关节无红肿；1分为趾关节红肿；2分为足趾和趾关节肿胀；3分为踝关节以下的足爪肿胀；4分为踝关节和所有关节肿胀、变形。大鼠所有关节炎指数之和则为每只大鼠关节炎指数值。

3.5 胸腺和脾脏指数的检测分别取大鼠胸腺和脾脏组织，除去脂肪并用滤纸吸干表面液体，再称量质量，胸腺（脾脏）指数=胸腺（脾脏）质量/体质量。

3.6 HE染色检测踝关节滑膜组织病理损伤将大鼠踝关节滑膜组织在4%多聚甲醛中固定过夜，经脱水、透明、包埋、切片后，进行HE染色，通过光学显微镜观察踝关节滑膜组织学变化。

3.7 ELISA法检测踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平严格按照试剂盒说明书检测大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平。

3.8 免疫组化检测踝关节滑膜组织中VEGF和KDR表达取3.6中的石蜡切片，经脱蜡、3%过氧化氢阻断内源性过氧化氢酶、封闭后，加入Ⅰ抗（VEGF抗体，1∶500；KDR抗体，1∶200）于4℃过夜孵育，次日加Ⅱ抗反应1 h，DAB显色，苏木素复染，封片。光学显微镜观察滑膜组织中呈棕黄处即为阳性表达，ImageJ软件用于评估积分吸光度和阳性表达面积，平均吸光度=积分吸光度/阳性表达面积。

3.9 Western blot检测踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达RIPA裂解液提取踝关节滑膜组织匀浆中的总蛋白，经定量、电泳、转膜、封闭后，将膜分别与Ⅰ抗（HIF-1α和GAPDH抗体，1∶2 000；VEGF抗体，1∶1 000）在4℃下过夜孵育，再在37℃下与Ⅱ抗（1∶2 000）共同孵育1 h。加入ECL试剂观察蛋白条带，Quantity One软件评估蛋白灰度值。

4 统计学处理

使用GraphPad Prism 8对数据进行统计分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间的差异比较采用单因素方差分析，进一步两组间的比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 BA对各组大鼠足趾肿胀度的影响

与control组比较，model组大鼠在0、7、14、21和28 d的足趾肿胀度均显著升高（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠在7、14、21和28 d的足趾肿胀度均显著降低（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠足趾肿胀度显著降低（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠足趾肿胀度差异均无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组则显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 黄芩素对各组大鼠足趾肿胀度的影响Table 1.The effect of baicalein（BA）on the toe swelling of the rats in each group（mL.Mean±SD.n=12）

2 BA对各组大鼠关节炎指数的影响

与control组比较，model组大鼠在0、7、14、21和28 d的关节炎指数均显著升高（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠在7、14、21和28 d的关节炎指数均显著降低（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠关节炎指数显著降低（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠关节炎指数的差异无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组则显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 黄芩素对各组大鼠关节炎指数的影响Table 2.Effect of baicalein（BA）on the arthritis index of rats in each group（Mean±SD.n=12）

3 BA对各组大鼠胸腺、脾脏指数的影响

与control组比较，model组大鼠胸腺和脾脏指数显著升高（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠胸腺和脾脏指数显著降低（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠胸腺和脾脏指数显著降低（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠胸腺和脾脏指数的差异无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组则显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 黄芩素对各组大鼠胸腺和脾脏指数的影响Table 3.Effect of baicalein（BA）on the thymus and spleen indexes of rats in each group（mg/g.Mean±SD.n=4）

4 BA对各组大鼠踝关节滑膜组织病理损伤的影响

HE染色结果显示，control组大鼠踝关节滑膜组织结构正常，无增生现象；model组大鼠踝关节滑膜组织增生，且有大量炎症细胞浸润；BA-L、BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织病理损伤有所减轻，可见少量炎症细胞浸润；与BA-H组比较，BA-H+DMOG组大鼠踝关节滑膜组织病理损伤加剧，呈现严重的滑膜增生及炎症细胞浸润，见图1。

5 BA对各组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平的影响

与control组比较，model组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平显著降低（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平显著降低（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平的差异无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平显著升高（P＜0.05），见表4。

Figure 1.Pathological changes of the ankle joint synovial tissue of the rats in each group（HE staining，scale bar=100 μm）.Black arrows represented inflammatory cell infiltration.BA：baicalein；TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.图1 HE染色检测各组大鼠踝关节滑膜组织病理变化

表4 黄芩素对各组大鼠踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平的影响Table 4.Effect of baicalein（BA）on the levels of TNF-α and IL-6 in the ankle joint synovial tissue of rats in each group（ng/L.Mean±SD.n=4）

6 BA对各组大鼠踝关节滑膜组织中病理性血管生成相关因子VEGF和KDR表达的影响

与control组比较，model组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达显著增多（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达显著减少（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达显著减少（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达的差异无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组则显著增多（P＜0.05），见图2。

Figure 2.Immunohistochemical detection of VEGF and KDR expression in rat ankle joint synovium.Brown yellow and brown were positive expression.The scale bar=100 μm.BA：baicalein；TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs BA-L group；▲P＜0.05 vs BA-H group.图2黄芩素对各组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达的影响

7 BA对各组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α/VEGF通路相关蛋白表达的影响

与control组比较，model组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与model组比较，BA-L、BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与BA-L组比较，BA-H和TWP组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与BA-H组比较，TWP组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达的差异无统计学意义（P＞0.05），而BA-H+DMOG组则显著升高（P＜0.05），见图3。

讨 论

RA是一种慢性系统性疾病，其中病理性血管生成可以促进炎症细胞浸润到关节中，导致滑膜炎症、增生和进行性骨破坏［13］。近年来，尽管RA的抗风湿新药显著延缓了RA进展并改善了RA患者的生活质量，但是新药所引发的不良事件增多，如肝肾毒性、严重感染和肿瘤的发生等［14］。因此，开发新的治疗RA的药物刻不容缓。本研究采用II型胶原蛋白-完全弗氏佐剂法诱导RA大鼠模型，结果显示，与control组比较，model组大鼠足趾肿胀度和关节炎指数均显著升高，大鼠踝关节滑膜组织病理损伤严重，提示RA大鼠模型构建成功。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺指数和脾脏指数可在一定程度上反映机体的免疫状态［10］；IL-6和TNF-α作为重要的促炎因子，在RA大鼠血清中含量显著升高［15］。本研究显示，与control组比较，model组大鼠胸腺指数、脾脏指数及踝关节滑膜组织中TNF-α和IL-6水平均显著升高，表明RA大鼠免疫系统被激活，进而在滑膜组织中释放大量炎症因子，导致滑膜炎症的发生。VEGF是促进血管内皮细胞生长的重要因子，可促进血管生成；而KDR作为VEGF上具有高亲和力的酪氨酸受体，在VEGF诱导的血管新生及增强血管通透性中起关键作用［16］。本研究显示，与control组比较，model组大鼠踝关节滑膜组织中VEGF和KDR阳性表达增多，表明RA大鼠病理性血管大量生成。以上结果表明，RA大鼠存在炎症反应及病理性血管大量生成。

Figure 3.Effect of baicalein（BA）on the protein expression of HIF-1α and VEGF in the ankle joint synovial tissue of rats in each group.TWP：Tripterygium wilfordii polyglycoside tablet；DMOG：dimethyloxallyl glycine.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs BA-L group；▲P＜0.05 vs BA-H group.图3黄芩素对各组大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达的影响

BA是黄芩根的天然产物，具有许多有益的药理活性，包括抗炎、抗氧化和免疫调节等［17］。据报道，BA可减弱过敏性鼻炎大鼠的炎症反应［18］，还可抑制胃癌细胞血管生成［19］。以上研究表明BA具有抑制炎症反应及病理性血管生成的作用。本研究结果与之一致。本研究显示，BA可抑制RA大鼠炎症反应及病理性血管生成，且BA剂量越高，该抑制作用越明显，而BA-H组与TWP组比较，对应指标变化差异无统计学意义，表明BA可能通过抑制炎症反应及病理性血管生成来延缓RA进展。

HIF-1α在正常氧气条件下迅速降解，但在缺氧条件下可大量合成并诱导VEGF的表达，然后VEGF促进内皮细胞的活化以诱导炎症，从而在RA中促进病理性血管生成和关节炎症［13］。相关研究显示，抑制HIF-1α/VEGF信号通路可减弱氧诱导的视网膜病变大鼠血管生成［20］，还可减轻急性肺损伤大鼠肺部炎症［21］。本研究结果与之一致。本研究显示，BA可抑制RA大鼠踝关节滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达，且BA剂量越高，对蛋白的抑制作用越明显。雷公藤多苷作为雷公藤的提取物，具有抗炎作用，已有研究报道雷公藤多苷可以改善类风湿关节炎患者Th17和Treg细胞数目失衡［22］。因此，本研究选用TWP作为阳性药物，且BA-H组与TWP组比较，HIF-1α和VEGF蛋白表达变化差异无统计学意义，推测BA可能通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路抑制RA大鼠炎症反应及病理性血管生成。为了验证该猜想，本研究在BA-H的基础上再以HIF-1α激动剂DMOG干预RA大鼠，结果显示，DMOG减弱了BA-H对RA大鼠炎症反应及病理性血管生成的抑制作用，证实上述猜想之正确，即BA可能通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路抑制RA大鼠炎症反应及病理性血管生成。

综上所述，BA可能通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路抑制RA大鼠炎症反应及病理性血管生成。BA可能成为治疗RA的潜在药物。