何向东

（巴中市南江黄羊科学研究所 636600）

传染病能降低羊生产性能，目前在畜牧业生产实践中控制措施基本应用抗菌药物，这往往会导致抗生素耐药菌株的发生。因此，动物疫苗接种，这必是行之有效的管理措施。对于动物而言，先天免疫系统是防御微生物感染的屏障，而绝大多数动物对病原体的处理完全依赖于先天免疫识别。脊椎动物已经进化出一个更复杂的防御系统，称为适应性免疫系统，以对病原体形成先天抵抗力。先天免疫系统能够识别微生物及其微生物代谢产物，通过编码的受体识别而发挥作用[1]。Toll样受体(Toi-like receptors，TLRs)是参与天然免疫过程中病原相关分子模式(Pathogen associtated molecular patterns, PAMPs)的特异性模式识别受体(Pathogen recognition receptors, PRRs),当与其相应PAMPs分子结合后，以诱导免疫应答和炎性反应的生物学功能。TLRs作为研究PRRs的热点之一，目前羊的TLRs已克隆出10个类型[2]。先天免疫系统的PRR中，尤其是Toll样受体(TLR)家族负责启动急性炎症反应，通过诱导抗微生物以对抗入侵的病原体基因和炎症细胞因子[3]。TLR信号可活化吞噬细胞和直接杀死传染性微生物，脊椎动物的免疫系统识别特定序列环境（CpG基序）中未甲基化的CpG，这在细菌基因组中比在脊椎动物基因组中更为普遍[4]。鉴于TLRs基因的表达和突变与炎症病理具有较高的相关性。因此，本文对羊的TLR家族进行综述，以期为羊的抗病育种提供重要理论支撑。

1 TLRs生物学结构及功能

TLRs作为I型跨膜糖蛋白，由胞外区、胞内信号区和跨膜区组成，其中胞外区特点在于其具有富含亮氨酸重复序列。该序列与宿主抗感染反应特异性相关，生理学功能在于可实现空间结构的变化来达到TLRs对病原成分进行识别。此外，跨膜区其特点在于富含半胱氨酸，该结构域生物学功能在于可决定TLRs分子的亚细胞定位。胞内信号区也被称为称Toll-IL-1受体(Tol-IL-1 receptor, TIR)结构域，与白介素-1受体家族的胞内区具有高度同源性，结合部位位于细胞内的髓样分化因子接头，诱导对应的免疫应答，阻止病原微生物的侵袭[5]。

激发TLR配体至少包括两个重要的信号通路，一是涉及MyD88的神经节蛋白由TLR激发，从而导致激活转录因子NF-κB和促炎-释放传导性细胞因子。二是驱动第二种途径抗原呈递细胞的成熟并增加MHC分子，共同刺激分子CD40和趋化因子受体CCR7的表达。以上信号均是被认为对T细胞介导的启动起着至关重要的免疫信号通路[6]。

2 羊TLRs研究现状

2.1 TLR4

Toll 样受体 4 (TLR4) 是一种模式识别受体(PRR) 在先天免疫和宿主中起关键防御作用。TLR4是脂多糖 (LPS) 的关键信号转导器，LPS 是革兰氏阴性菌的主要胞外成分。TLR4的激活可以促进细胞增殖和凋亡[7]。

TLR4通过下游适配器来激活主要反应基因88（MyD88）和含TIR结构域的衔接子-诱导干扰素-α-（TRIF-α）依赖的途径，通过核因子-kβ-（NF-kβ-）起作用的生理机制[8]。TLR4在转基因绵羊中的过表达可能会加速刺激脂多糖分泌，通过NO生成来清除入侵微生物。此外，TLR4过表达也增强鸟苷三磷酸环水解酶（GCHI）活性，该酶是四氢生物蝶呤的限速酶（BH4）合成酶，这对于生产诱导型一氧化氮合酶来说必不可少[9]。急慢性呼吸道引起羊生产性能降低甚至死亡，吕伟丽[10]选择TLR4、TLR9基因作为研究对象，分析该基因的遗传多态性及变异特征，采用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)对山丹县、陇西县和永昌县表型正常作为对照组和患有呼吸道疾病作为试验组的小尾寒羊TLR4基因外显子3和TLR9基因的多态性进行检测，结果发现小尾寒羊TLR4外显子3的AA、AB基因型与抗呼吸道疾病感染的遗传潜力有关。这些依据对小尾寒羊的遗传特性和生产利用提供基础数据。

2.2 TLR7

梁田等[11]对新疆萨福克羊Toll样受体7基因单核苷酸进行多态性分析，采集新疆地区种羊场萨福克羊血液，采用PCR-SSCP方法进行检测，对突变位点进行测序分析，序列比对分析存在A343G、A350G、A1244G的错义突变,氨基酸改变分别是Lys→Gln, Asp→Ser, Glu→Arg，且突变都发生在胞外区亮氨酸重复区内；带型AB是位点A343G和A350G同时发生突变；以上突变可能改变TLR7基因的功能，进而影响免疫应答，为探索绵羊TLR7基因多态性与抗病力的关系和提高羊抗病育种提供候选分子标记。

2.3 TLR9

Zhou等[12]共发现羊4个SNP位点，其中1323 C/T 、1340 G/A、1384 G/T 和1452 G/A，其中第2个和第3个分别发生Arg/Gln 447 和Ala/Ser 462 氨基酸变化，这种替代会影响TLR9的功能，因而对疾病有易感性。TLR9基因可以作为小尾寒羊抗呼吸道疾病的候选基因，AA型可以作为小尾寒羊抗呼吸道疾病的标记基因型[10]。

回肠或空肠中TLR1-5和8的表达增加，肠系膜淋巴结中TLR1-4、6和8的表达增加。与未暴露的动物相比，暴露的周边血液单核细胞中TLR1、2和6-8的表达有增加的趋势。这些差异结果有助于探明反刍动物约翰氏病中TLR表达的情况和助于解释发病机理，在将来诊断副结核病感染中有重要作用[13]。以塔什库尔干羊、和田羊和多浪羊共107个样本为研究对象，采用PCR、测序法和生物信息学方法分析TLR9基因的SNP及氨基酸差异。发现7个SNP，其中3个位点为同义突变，4个位点为非同义突变，确定为12个等位基因，其中新发现6个等位基因。首次发现氨基酸G437R的突变，可能影响机体对PAMP的识别。绵羊TLR9基因外显子2具有较高的多态性，导致LRR空间结构发生改变，进一步影响机体对疾病的感受性，这为新疆南疆地区绵羊抗病育种提供基础数据[14]。

PCR-SSCP分析来研究绵羊TLR9基因关键区域的遗传变异，确定了代表三种不同序列的三种新型SSCP 模式。在单个绵羊中检测到存在不同的序列，并且所有鉴定的序列与来自多种物种的TLR9序列具有高度同源性，表明这些序列代表了绵羊TLR9 基因的等位基因变体。在扩增的区域中检测到四个单核苷酸多态性 (SNP)，其中两个是会导致氨基酸变化的非同义替换。这里检测到的变异可能对 TLR9 的结构和/或功能产生影响，从而影响对病原体的免疫反应[14]。

3 展望

TLRs在作为识别、启动、激发病原体的重要免疫应答调控分子，已成为羊抗病育种的研究热点。目前国内外学者对TLRs的研究主要集中于消化道和呼吸道疾病，对其他疾病研究还知之甚少。因此，TLRs抗病的分子机制是否与其他降低羊生产性能疾病有效，且在遗传选育中作为抗病标记分子还需要做一步研究。