韩兆盛，王 姣，王亚东，康志远，王世杰，姚 欢，王 蓓*，孟繁宇

（1 北京工商大学食品与健康学院 北京100048 2 石家庄君乐宝乳业有限公司 石家庄050221 3 威县君乐宝乳业有限公司 河北邢台 054700）

牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪和氨基酸等营养成分，营养丰富，然而，极易受微生物污染，因此原料牛乳经过收集、运输及贮存后，对其进行有效灭菌，是生产加工前一项必不可少的步骤[1-3]。目前，超高温瞬时杀菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）和巴氏杀菌是应用比较广泛的两种牛乳杀菌方式[4]。巴氏杀菌一般是在72～85 ℃温度范围，持续杀菌15 s 来达到杀菌的目的[5]。UHT 杀菌技术则是将牛乳快速加热到135～140 ℃，杀菌3～4 s 来达到灭菌的一种方法[6]。浸入式杀菌技术（Infusion technology，INF）是一种新型的牛乳热杀菌技术，该技术直接将牛乳与蒸汽进行混合而杀菌，杀菌温度高达143～158 ℃，杀菌时间短至0.1 s 左右[7]。其杀菌温度较UHT高，而杀菌时间更短。目前，国内外关于INF 乳中风味物质的研究较少，因而确定INF 杀菌方法对牛乳风味的影响，对牛乳杀菌方法的改进与创新具有重要意义。

牛乳作为一种组成复杂的胶体，其化学成分受热处理的影响较大，特别是加热后风味物质的改变会直接影响牛乳的感官品质[8]。牛乳制品的挥发性风味物质种类繁多，而其含量较低，在杀菌过程中易发生改变的特性使牛乳风味物质的研究变得更加复杂。溶剂辅助风味蒸发法（Solvent assisted flavor evaporation，SAFE）是利用高真空泵维持高真空状态和利用液氮营造低温环境来萃取食品中挥发性风味组分的一种萃取方法。该萃取技术具有回收率高，可萃取吸附更多的极性风味物质和精准定量等诸多优势。SAFE 因具有高真空的特点而被用于高沸点或难挥发性物质的萃取，萃取得到的成分没有“煮熟”味，香气物质自然真实[9]，尤其适合提取液态乳制品等食品中的挥发性成分[10]。关于利用SAFE 法萃取牛乳风味的相关研究已有较多报道，如：艾娜丝等[11]对比了SDE 与SAFE 来分析全脂巴氏乳的挥发性成分；刘南南等[12]利用SAFE-GC-MS 分析酸牛奶挥发性成分；Kirsch 等[13]利用SAFE 萃取母乳中的风味化合物，并进行了定性、定量分析。

本研究以SAFE 这一风味萃取技术，结合气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）为研究方法，对原料乳在进行不同杀菌工艺处理后的风味物质的变化情况进行分析，同时结合感官评定试验和统计学方法，研究不同杀菌方法对牛乳风味组分与感官品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳、巴氏杀菌乳、INF 乳和UHT 乳均来自于君乐宝提供的相同乳源的同一批次牛乳。生牛乳中蛋白质质量分数为3.38%、脂肪质量分数为3.35%、乳糖质量分数为4.64%，pH 值为6.66。

正构烷烃（C7～C24，色谱纯级），美国o2si smart solutions 公司；2-甲基-3-庚酮（色谱纯级），sigma 公司；氦气（纯度99.999%），北京氦普北分公司；二氯甲烷（色谱纯级），北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

DB-WAX 型毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），美国Agilent 公司；7890B-5977A 型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；氮吹仪，天津奥特塞恩斯仪器有限公司；SAFE 装置，德国Glasblaserei Bahr 公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳中风味组分萃取 1 000 mL 圆底烧瓶用于收集废液，并稳定在40 ℃的恒温水浴锅中；500 mL 圆底烧瓶用于收集萃取液，置于-196 ℃液氮的冷阱中。整个SAFE 装置需要维持在10-6的真空度下进行，并且循环水浴的温度保持在50 ℃。待SAFE 装置的真空度和水浴温度都稳定后，将200 mL 牛乳和200 μL 内标物2-甲基-3-庚酮（0.816 mg/mL）混匀后倒入SAFE 装置的分液漏斗中，打开滴液漏斗活塞，缓慢滴加，萃取过程中保证真空泵的压力处于稳定状态。待滴液漏斗中剩余少量牛乳时，停止萃取，关闭真空泵，压力逐渐释放。将萃取液移至250 mL 分液漏斗中，同时用重蒸后的50 mL 二氯甲烷分3 次进行萃取得到有机相，用100 mL 圆底烧瓶接收有机相后，将圆底烧瓶置于50 ℃水浴锅中，用Vigreux 柱精馏浓缩后进行氮吹至200 μL，然后取1 μL 萃取液进行GC-MS 分析。试验重复3 次取其平均值。

1.3.2 GC-MS 分析方法

1.3.2.1 GC 条件 使用DB-WAX 毛细管柱。色谱柱的升温程序为：初始柱温40 ℃，维持2 min，以7 ℃/min 升温到75 ℃；再以2 ℃/min 升到150℃；最后以5 ℃/min 升到230 ℃，保持2 min。载气（氦气）的流速为1.2 mL/min，采用不分流模式。

1.3.2.2 MS 条件 进样口温度设置为250 ℃，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃；采用全扫描模式，质量扫描范围为m/z 35～350；电子电离（Electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV。

1.4 定性、定量分析

1.4.1 定性分析 利用4 种方法来定性化合物：质谱库检索（MS）、保留指数（RI）、嗅闻（O）和标准化合物（S）。

1.4.1.1 质谱库检索（MS）在NIST14 谱库中进行化合物的检索与分析。

1.4.1.2 保留指数（RI）将通过公式计算得出的保留指数（RI）值与文献中的保留指数值进行对比确认化合物。保留指数的计算方法为：在相同的色谱条件下测定系列正构烷烃C7～C24 与牛乳样品，从而得到保留时间，再根据计算公式可求出待测化合物的RI 值（tn

式中，RI——待测化合物的保留指数；ti——待测化合物i 的保留时间，min；tn——碳原子数为n 的正构烷烃的保留时间，min；tn+1——碳原子数为n+1 的正构烷烃的保留时间，min。

1.4.1.3 气相色谱-嗅闻（Gas chromatography-olfactometry，GC-O）将气相色谱与嗅探系统相结合，用于嗅闻气味活性成分。取1 μL 的萃取液注射到气相色谱，为了避免气味物质的遗漏与损失，由4 名通过专业培训的小组成员进行嗅闻，嗅闻人员记录嗅闻得到的味道、强度以及时间。如果有两位或两位以上成员嗅闻到气味，则可以确定嗅闻到气味的时间。然后将嗅闻结果与该化合物的标准品进行对比，进一步确定化合物的气味。

1.4.1.4 标准化合物（S）取一系列牛奶风味化合物的标准化合物进行GC-MS 测定，并与在同一GC-MS 条件下测定的牛奶样品中的化合物进行比对，当标准化合物和牛奶样品中的化合物均在同一时间被检测到，则可判断出两者为同一种化合物。

1.4.2 定量分析 根据风味化合物与内标化合物的峰面积之比等于其含量之比来计算得出各化合物的含量。

1.5 感官评价

由11 位专业感官评价成员组成的感官评价小组针对4 种牛乳的奶香味（前味）、奶香味（后味）、入口甘甜、回味甘甜、口感浓厚程度和蒸煮味这6 个感官属性进行了感官评价，评价属性及标准见表1[14-15]。生牛乳的所有牛乳样品尝时均在口中停留5 s 后吐出，并依次用0.7%的无菌生理盐水、清水漱口清洁口腔。

表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.6 数据处理

本研究采用SIMCA 14.1 进行偏最小二乘回归（Partial least squares，PLS）分析；所有表格绘制采用Excel 2019 进行处理。

2 结果与分析

2.1 杀菌方法对风味成分的影响

牛乳中的挥发性化合物的含量较低种类较少，很难对其进行全面的检测，因此本研究采用SAFE 能够萃取到更多的风味化合物。应用GCMS 和GC-O对生牛乳、巴氏杀菌乳、INF乳和UHT 乳这4 种牛乳进行测定与分析。在4 种牛乳中共检测出48 种挥发性风味化合物，其中嗅闻检测得到30 种，主要为酸类、酮类、醛类等化合物。在4 种牛乳样品中，UHT 乳中检测得到的风味化合物的种类和含量最多，其次是INF 乳和巴氏杀菌乳，最后是生牛乳。图1 展示了牛乳中各类风味化合物的含量，其中4 种牛乳样品中含量最高的均是酸类组分，其次是酯类组分或芳香及杂环类化合物，含量较小的是醛类、酮类和醇类组分。此外，不同杀菌方法对应的各类化合物含量有所差别，因而杀菌方式对牛乳风味有一定影响，接下来对表2 中各类物质分别讨论。

图1 不同热杀菌条件下牛乳中化合物含量的变化图Fig.1 Changes of compound content in milk under different thermal sterilization conditions

2.1.1 脂肪酸类化合物 牛乳中约98%的脂肪酸以三酰基甘油的形式存在，必须通过脂肪酶或加工应激释放才能形成香气化合物。牛乳中的许多关键香味和风味来自于牛乳脂肪中的短链（C4～C5）和中链（C6～C10）脂肪酸[16]，脂肪酸不仅是芳香成分，而且是甲基酮、醇、内酯、醛和酯形成的前体[17]。生牛乳和3 种杀菌方式的分析结果表明生牛乳共检测出11 种脂肪酸类化合物，巴氏杀菌乳中8 种，INF 乳中9 种，UHT 乳中11 种，其中除了长链脂肪酸和丙酸外，均能嗅闻得到，因此脂肪酸类化合物对牛乳风味贡献较大。此外，值得注意的是不同牛乳样品中丁酸、己酸等具有较低阈值的中短碳链脂肪酸含量相差较大。这些中短碳链的脂肪酸在低浓度时具有奶香味，而含量过高时则会呈现出较强酸臭气味，是牛乳中关键挥发性风味组分。4 种牛乳样品中UHT 乳中脂肪酸总含量最高（27 962.86 μg/kg），其丁酸和己酸的含量明显高于其它两种杀菌工艺。说明了随着杀菌处理强度的增加，牛乳中脂肪酸总含量随之增加。然而，巴氏杀菌乳和INF 乳中的脂肪酸类化合物含量差别不大，说明两者杀菌程度比较相似。

2.1.2 酮类化合物 酮类化合物通常以甲基酮的形式存在，甲基酮是由脂肪酸氧化降解所产生。甲基酮的生成过程包括脂肪酸（主要从C6 到C12）氧化为β-酮酸，然后β-酮酸脱羧得到相应的少一个碳原子的甲基酮[18]。牛乳中常见的甲基酮如2-庚酮，2-壬酮和2-十一酮等有助于形成乳制品的独特风味，并且它们具有较低的感知阈值[19-20]。表2 中列出了4 种牛乳样品中的甲基酮类物质，UHT乳5 种，巴氏杀菌乳3 种，INF 乳2 种，生牛乳1种。其中检测得到的酮类化合物中能够被嗅闻得到的有4 种，主要分布在UHT 乳中，而生牛乳未检出任何嗅闻化合物，因此酮类组分也是牛乳杀菌过程中产生的关键风味组分。此外，就酮类化合物含量而言，3 种杀菌乳中的酮类总量明显高于生牛乳，其中UHT 乳中酮类化合物的含量最高，而巴氏杀菌乳与INF 乳两者间甲基酮含量接近。其中，2-壬酮在3 类杀菌乳中，含量随着加热强度的增加逐渐加大（巴氏杀菌乳21.42 μg/kg，INF 乳35.58 μg/kg，UHT 乳31.03 μg/kg），说明高温会促进2-壬酮的合成。大部分甲基酮化合物的阈值均较低（如：2-十一酮阈值为6.2 μg/kg[21]），且大部分具有良好热牛奶味道，其对牛乳的感官品质的提升具有积极作用。

2.1.3 醛类化合物 醛类主要来自于不饱和脂肪酸的氧化和氨基酸的微生物降解（转氨化后脱羧）或通过Strecker 降解[22]。戊醛和庚醛等部分醛类还可能来源于光氧化。当牛乳受到光照时，光照和氧气与乳脂中的不饱和脂肪酸三酰甘油发生反应，形成各种羰基化合物，从而产生油脂氧化味道[23]。此外，醛类还可以通过醇脱氢酶还原为醇或通过醛脱氢酶氧化为羧酸[23]。表2 显示：有6 种醛类化合物在生牛乳和3 种杀菌方式的牛乳样品被检测到，其中生牛乳2 种，巴氏杀菌乳3 种，INF 乳2种，UHT 乳4 种。检测到的醛类化合物大部分都能被嗅闻到，其中己醛和壬醛作为牛乳中重要的醛类物质，大多具有青草和果木香气[24]，其在巴氏杀菌乳和INF 乳中均能被嗅闻到，而且其含量在这两类乳中相近，所以巴氏杀菌乳和INF 乳的风味特征较为相似。随着杀菌强度的增加，己醛和壬醛的含量普遍降低，说明杀菌温度的增加可能会导致中短碳链的醛类发生进一步反应而损失。此外，长链醛类如十二醛和十四醛仅在杀菌强度较高的UHT 乳检测得到，可能是高温下乳脂肪进一步氧化的产物。醛类化合物是牛乳中常见的风味化合物，尤其存在于热处理后的牛乳中，其具有的油脂味道带给牛乳独特的风味感受[25]。

2.1.4 酯类化合物 通常游离脂肪酸和短链脂肪醇通过酯化反应会形成酯类化合物，甲酯类和乙酯类是牛奶中常见的酯类物质[26]。酯类物质具有果香、清甜的味道，对提高乳制品风味层次和感官品质产生积极作用[27-28]。由表2 可知：在酯类化合物中仅有十六酸甲酯被嗅闻得到，并且其含量明显高于其它酯类，十六酸甲酯在巴氏杀菌乳中其含量较高，可能是较温和的杀菌条件更有助于十六酸甲酯的存在。在检测到的酯类化合物中仅有乙酸丁酯这一短链酯类被检出，其它被检出的多为长链酯类，其中十四酸异丙酯和十六酸甲酯均存在于4 种牛乳中。酯类化合物一般具有水果气味，如乙酸丁酯和十六酸甲酯具有水果味，十四酸甲酯具有蜂蜜味，酯类一般能赋予牛乳较好的感官特征。

2.1.5 含硫化合物 含硫化合物是牛乳蛋白质（如β-乳球蛋白和乳脂球膜蛋白）在高温下变性降解为含硫氨基酸（如半胱氨酸和蛋氨酸），进而含硫氨基酸被氧化或者Strecker 降解所产生的[29-30]。蛋白质水解产生的多肽和氨基酸可以催化生成α-酮酸，然后脱羧生成醛，醛最终脱氢生成醇，α-酮酸的降解也会产生甲烷硫醇，随后氧化形成含硫化合物[31]。由表2 可知：4 种牛乳中能检测到二甲基硫和二甲基砜这两种含硫化合物，并且这两种含硫化合物均能够被嗅闻得到。其中，二甲基硫具有蒸煮味味，二甲基亚砜具有硫磺味和大蒜味。UHT 乳中的含硫化合物总量明显高于另外3 种牛乳，说明杀菌强度越大越易形成含硫化合物，这类组分也是造成UHT 乳中蒸煮味的主要原因。

2.1.6 醇类化合物 醇类物质通常是由醛类通过酶作用或物理作用所产生，其中仲醇可能是由相应的甲基酮酶还原而成[32]。醇类物质由于阈值较高[33]，对牛乳的整体风味贡献较小。由表2 可知：有4 种醇类化合物能够被嗅闻得到，就其含量而言，生牛乳和巴氏杀菌乳中醇类的总含量会稍微高于INF 乳和UHT 乳，可能原因是醇类在加热过程中会发生微小的损失。长链醇类（如十二醇和十四醇）的含量随着杀菌温度的增加而减少，可能是高温会使醇类化合物损失或者转化为其它物质。UHT 乳中醇类化合物的种类和含量较其它3 种牛乳来说相对较低，因此醇类物质在UHT 乳中呈现的味道较弱，对牛乳香气的贡献度较小[32]。

2.1.7 芳香及杂环类化合物 生牛乳和3 类杀菌乳中共检测出13 种芳香及杂环类化合物。生牛乳6 种，巴氏杀菌乳7 种，INF 乳8 种，UHT 乳12种。由上述检测结果可知：共有7 种芳香及杂环类化合物能够通过嗅闻得到，UHT 乳中芳香及杂环类化合物的种类和含量明显高于另外3 种牛乳。其中4 种牛乳中均有柠檬烯，这与Contarini 等[34]检测的结果一致，柠檬烯作为牛乳中主要的萜烯烃化合物，是从奶牛食用的植物混合物中提取得到[7]。苯甲醛、呋喃醛和呋喃醇仅在UHT 乳中检测到，可能会引起UHT 乳中出现苦杏仁味。

2.2 牛乳中主要香气化合物组分的香气活性值（Odor activity value，OAV）分析

牛乳中风味化合物的嗅觉强度与化合物的浓度和气味阈值密切相关，因此OAV 值作为挥发性风味化合物浓度与阈值的比值，能够清晰的展现出风味化合物的气味强度，并且表示出挥发性化合物的风味对于牛乳整体风味的贡献程度。OAV值大于1 说明该化合物对牛乳的整体风味贡献较大；OAV 值小于1 说明该化合物对牛乳的整体风味有辅助贡献。OAV 值越大说明该化合物对牛乳整体风味的贡献率就越大，反之亦然。

将表2 中检测得到的风味化合物进行OAV分析，其中OAV>1 的物质见表3。生牛乳中OAV值大于10 的化合物主要有十六酸甲酯、十六酸乙酯、己醛、壬醛、十二醇和二甲基硫，上述化合物主要具有水果味、青草味、油脂味、花香和蒸煮味，这些气味的相互作用构成了生牛乳的主要风味。巴氏杀菌乳中，OAV 值大于10 的化合物主要有十六酸甲酯、壬醛、2-壬酮、十二醇、乙酸丁酯和二甲基硫，这些风味化合物能够赋予牛乳水果味、油脂味、奶香味、花香和蒸煮味。INF 乳中，OAV 值大于10 的化合物主要有己醛、壬醛、癸醛、2-壬酮、十二醇、乙酸丁酯、十六酸甲酯和二甲基硫，主要具有水果味、青草味、油脂味、奶香味、花香和蒸煮味。UHT 乳中，OAV 值大于10 的化合物主要有壬醛、2-壬酮、十二醇、十六酸甲酯、二甲基硫和苯乙烯，这些风味化合物主要呈现出水果味、塑料味、油脂味、奶香味、花香和蒸煮味，这些风味对UHT乳的整体风味具有较大影响。

表3 牛乳中化合物的OAV 值Table 3 OAV values of compounds in milk

虽然理论上而言，OAV 值大于1 的化合物一般都能被嗅闻到，但是实际由于嗅闻过程中存在嗅觉疲劳等原因，并不是所有OAV 值大的化合物都能被嗅闻得到，如辛醛和2-十五酮。此外，由于食品体系组成复杂，而阈值测定过程中大多选择水、油等简单基质作为其测定体系，因而实际阈值与测定阈值间还存在一定差别，因此会存在OAV值小于1 的化合物能够嗅闻到的现象，如乙酸和2-庚酮。

2.3 感官评价和偏最小二乘（PLS）分析

PLS 分析适用于样品数量少而相关自变量较多的情况，为了能够找到不同杀菌方式牛乳的关键香气成分，采用偏最小二乘对牛乳的感官特征与风味化合物进行分析。由感官评价小组针对4种牛乳的奶香味（前味）、奶香味（后味）、入口甘甜、回味甘甜、口感浓厚程度和蒸煮味这6 个感官属性进行了感官评价。利用偏最小二乘分析将4种牛乳的感官评价结果与风味化合物结合起来，对两者之间的相关性进行进一步分析。由图2 可知：巴氏杀菌乳和INF 乳的关键风味组分和感官特征较为相似，其甜味和奶香味（前味）均较浓郁，上述感官属性和挥发性化合物2-壬酮、2（5H）-呋喃酮、乙酸丁酯等相关性较大；UHT 乳的蒸煮味和浓厚程度较为明显，该感官特征和UHT 乳中的含硫化合物和甲基酮类化合物相关性较大，如二甲基砜、二甲基硫、2-乙基-1-己醇、2-十三酮等；而生牛乳的每个感官属性强度都相对较淡，与上述3 类杀菌乳有较大的区别。生牛乳的感官属性与长链的脂肪酸、醇、酯等化合物相关性较大，如十六醇、十六酸乙酯和癸酸等。

图2 4 种牛乳样品的感官属性与特征风味组分偏最小二乘分析（PLS）Fig.2 The relationship between sensory properties and key aroma components of four milk samples analyzed by the partial least squares analysis（PLS）

3 结论

本研究通过SAFE 萃取了4 种不同杀菌方式的牛乳，经GC-MS 和GC-O 进行测定与分析后得到48 种香气物质，嗅闻得到30 种化合物。其中2-壬酮（奶香味）、己醛（青草味）和壬醛（油脂味）作为牛乳中的关键风味组分香气特征较为明显。对样品中风味组分的OAV 分析结果表明：OAV值较高的组分有十六酸甲酯、己醛、壬醛、癸醛、2-壬酮、十二醇、乙酸丁酯、二甲基硫和苯乙烯，具有的水果、青草味、油脂味、奶香味和花香味对牛乳的整体风味贡献较大。最后PLS 结果表明巴氏杀菌乳和INF 乳的风味特征较为接近，都具有浓郁的奶香味与甜味，且与之对应的化合物为2-壬酮、2（5H）-呋喃酮、乙酸丁酯。UHT 乳中的蒸煮味较强烈、口感也相对更加浓厚，对该类牛乳风味贡献较大的组分为二甲基砜、二甲基硫、2-乙基-1-己醇和2-十三酮等。本研究通过对不同杀菌方式的牛乳进行化合物种类和含量、感官评价和PLS等的分析，旨在得出不同杀菌方式牛乳的异同点及消费者偏好，为研究出更多口感良好、符合消费者口味的牛乳提供依据。