王丹妮 张三元

近年来各类细胞因子在肿瘤分子诊断中的应用越来越广泛，有助于判断肿瘤治疗效果及评估预后。叉头框蛋白C2作为一种参与细胞增殖分化的转录因子，已被发现在多种恶性肿瘤细胞中发挥作用。将其应用于妇科常见恶性肿瘤的诊治过程中，或可实现肿瘤的早发现、早治疗，改善预后。

1 叉头框蛋白概述

1.1 叉头框蛋白的结构及功能 叉头框(forkhead box，FOX)蛋白是一类转录因子家族的总称，由Weigel等[1]于20世纪80年代在果蝇体内首次发现。FOX蛋白家族拥有相同的DNA结构域，该结构域由3个α螺旋和2个特殊的翼状结构组成，称为叉头框或翼状螺旋结构域，包含100个氨基酸序列，在不同物种间维持着稳定的表达状态，这使得FOX蛋白家族有着相似的生物学特征。而每个成员又有着除此之外不同的功能结构域，这些不同的功能结构域决定他们在肿瘤中起着不尽相同的作用[2]。1998年在美国加州举行的第一届叉头/翼状螺旋蛋白国际会议上，对FOX蛋白进行了规范化的命名。通过对其系统化发育过程的分析，将其分为不同的亚类，每种亚类用大写英文字母表示，每种亚类中的蛋白质都用阿拉伯数字将其区分开(例如FOXM2)[3]。

迄今为止，FOX家族已发展至19个基因亚家族(FOXA到FOXS)，他们在胚胎发育过程中发挥着重要作用，其中包括细胞增殖、分化、凋亡等大量的生物过程[4]。此外，近期研究发现，FOX家族能够与多种肿瘤因子及途径相结合，增强细胞在恶劣环境中的存活能力[5]，干预肿瘤的发生、发展、转移及预后。例如，诱导间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞是治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的有效方法之一，Zeng等[6]研究发现，在小鼠骨髓间充质干细胞中FOXM 1的过表达可激活Wnt/β-catenin信号通路，从而提高间充质干细胞(MSCs)向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的效率，为临床上治疗ARDS提供了一种新思路。一项对结直肠癌(CRC)的研究表明，FOXP2在CRC中的表达明显低于正常结肠上皮细胞(FHC)，因此得出FOXP2在CRC中起着类似抑癌基因的作用[7]。进一步研究显示，微RNA-190b(miR-190b)通过对FOXP2的表达抑制，促进CRC的增殖与浸润，发挥其癌基因的作用。在膀胱癌(BC)的癌细胞增殖过程中，已证实有多种信号通路及转录因子共同参与。Li等[8]发现BC中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路，FOXO1作为该通路下游的一个重要因子，可以与异质性核糖核蛋白F(hnRNP-F)的启动子相结合，抑制其转录，从而影响hnRNP-F对BC的作用。Western blot和RT-qPCR方法可以检测到hnRNP-F在人BC细胞中高表达，进一步研究发现，当用PI3K/AKT信号通路抑制剂处理BC细胞时，hnRNP-F的蛋白水平降低，当加入FOXO1后，hnRNP-F降低的程度较前有所缓解，再次证明FOX01K可影响hnRNP-F对BC的作用[8]。

有研究显示，利用FOX蛋白干预肿瘤进展的过程，或许可以将FOX蛋白开发成为癌症的一种靶向治疗药物靶点[3]。有些物质例如小干扰RNA(siRNA)以及几类蛋白酶抑制剂[5]，可以抑制癌细胞中FOX蛋白及其他的调节因子，从而抑制癌细胞的浸润及扩散。Xu等[9]总结了多种近年来发现的可以靶向作用于FOXM1的物质，例如柔红霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶等，这些药物可以通过干扰FOXM1启动子的功能，抑制其在肿瘤细胞中的表达，从而使肿瘤细胞凋亡，来达到治疗目的。将一种新型的多肽物质(9R-p201)引入肝癌细胞后，可见该新型的多肽聚集在细胞核内，通过干扰FOXM1在肝癌细胞中的转录及翻译，从而靶向性的抑制肝癌细胞的增殖、转移，以及诱导细胞的凋亡[10]。

1.2 叉头框蛋白C2的结构及功能 叉头框蛋白C2(FOXC2)是FOX蛋白家族的成员之一，其基因位于第16号染色体(16q24)上，只含有一个单独的外显子[11]。与该家族中的许多成员一样，有着典型的FOX蛋白DNA结构域，因此也表明了FOXC2在不同物种间同样呈高度保守的状态。FOXC2在活跃增殖的胚胎细胞中大量存在。当细胞进入合成期时，FOXC2在细胞核中积聚，以调节基因转录，并在组织和器官的形成和重塑中发挥作用。通过对包括FOXC2、FOXO1在内的6个调节因子基因的重新编程，Toyosaki等[12]在小鼠体内成功地将脂肪细胞重组为成纤维细胞，为重度烧伤患者的大量皮瓣移植另辟蹊径。Nian等[13]研究表明，糖尿病患者脂肪组织中FOXC2的表达情况明显低于对照组患者，FOXC2的表达上调可以使脂肪组织中血糖、血脂(主要为三酰甘油)降低，从而缓解胰岛素抵抗，表明FOXC2在糖尿病患者糖脂代谢过程中发挥着极大的作用。胚胎阶段心脏的发育依赖于心脏神经嵴细胞的增殖及分化，FOXC2与其同源的FOXC1作为心脏发育过程中重要的调节因子，在心脏神经嵴细胞中缺乏可导致心脏结构发育异常，例如室间隔缺损，心室发育缺陷等[14,15]。从而证实FOXC在胚胎发育过程中不可或缺的作用。

2 FOXC2与肿瘤

2.1 FOXC2与上皮间充质转化概述 虽然FOXC2在肿瘤发展过程中的具体作用机制尚不明确，但近年来众多专家学者从上皮间充质化(epithelial mesenchymal transition，EMT)入手，着重研究FOXC2与上皮间充质化的关系。EMT是细胞形态发生转变的过程，指上皮细胞向间充质细胞的转化，主要生物学特点是细胞间的连接及极性丧失，而使静止的上皮细胞获得了移动性及侵袭性。在这一过程中，上皮性的标记物(E-cadherin和β-catenin)表达明显减弱，间充质性的标记物(如N-cadherin、Vimentin和Snail等)表达增加[16,17]。此外，被破坏的粘附连接结构还可释放一些信号通路相关因子，作用于对应的肿瘤信号通路，进一步促进了EMT的发生[18]，可能是肿瘤发生浸润与转移的原因。EMT可发生在胚胎发育、伤口愈合等正常的生理过程中，并且在这些过程中细胞的转化是可逆的。研究表明，包括FOXC2在内的多种信号通路及转录因子的异常表达可诱导细胞发生EMT[19,20]。蒋琳等[21]实验表明，FOXC2在食管癌细胞中高表达，而在正常食管上皮细胞中低表达。FOXC2的异常表达对促进MMP9及Snail的表达差异有统计学意义(P<0.05)，进而可以刺激细胞发生EMT，使癌细胞发生侵袭及转移。对于肿瘤进展过程中极为常见的Wnt/β-catenin信号通路，FOXC2的低表达却明显抑制该通路中相关因子Wnt3a的表达，其结果具有统计学意义，提示我们在食管癌细胞中，FOXC2可能有抑制Wnt/β-catenin信号通路的作用，为判断肿瘤侵袭、转移及预后提供了重要证据。

耐药性一直以来直接影响着癌症的疗效，一旦发生通常提示预后不良。EMT被证实存在于多种癌症细胞耐药的发生过程中，而FOXC2作为EMT的关键调节因子，也在此过程中发挥重要作用。Chen等[22]研究发现，在对奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞中发生了EMT，且FOXC2在该类细胞中呈高表达状态。进一步行QRT-PCR及WestrenBlotting研究其作用机制，结果显示，FOXC2是通过抑制E-cadherin的表达以及增强Snail、Vimentin的表达，进而刺激癌细胞发生EMT，降低了其对奥沙利铂的敏感性。此外，FOXC2还可通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路参与细胞耐药性。

2.2 FOXC2与子宫颈癌 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，位于全球女性发病率和死亡率的第四位，2018年全球确诊人数约57万例，其中死亡约31万例[23]。宫颈癌的筛查方法目前较为成熟，多数在癌前病变即可诊断及治疗。目前宫颈癌的主要病原体仍为高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)，宫颈癌是多因素、多分子过程共同作用的后果。Wang等[24]对66例宫颈癌，42例宫颈上皮内瘤变(CIN)以及25例宫颈炎病理标本进行了免疫组化及RT-PCR实验，检测这些组织中FOXC2、N-cadherin、E-cadherin等转录因子的表达情况。结果显示，FOXC2、N-cadherin等的阳性表达率在宫颈癌组织、CIN及炎症组织中逐渐降低。而E-cadherin的结果恰好与之相反。结果说明FOXC2的高表达与宫颈癌的病理类型、临床分期及分化程度等指标相关，且在宫颈癌组织中，FOXC2、N-cadherin表达上调，E-cadherin表达下调，提示FOXC2可能是通过促进细胞EMT进程来影响癌细胞的增殖与扩散的。众多实验证实FOXC2在宫颈癌中的关键作用，如Zheng等[25]发现，FOXC2主要集中在宫颈癌组织的间质及间质血管附近，尤以新生血管附近为著，在淋巴管附近也可观察到FOXC2的表达，这表明FOXC2的表达可随血管的增生而增加。CCK8实验发现，利用siRNA瞬时下调Hela及SiHA两种宫颈癌细胞中FOXC2的表达，细胞的增殖与迁移能力在两种细胞中均有所减弱，且差异有统计学意义(P<0.05)[25]。当靶向沉默FOXC2在细胞中的表达时，细胞的增殖及扩散能力随之下降，这为宫颈癌的靶向治疗提供了理论依据。与FOXC2同源的FOXC1的表达与肿瘤分期，分化程度亦密切相关，当癌细胞中出现FOXC1的异常高表达，往往提示预后不良。

有研究表明叉头框C2蛋白与宫颈鳞癌的发生有密切关联，叉头框C2蛋白可有效影响结肠癌转移相关因子的表达，结肠癌转移相关因子可驱动肿瘤进入转移阶段，叉头框C2蛋白导致结肠癌转移相关因子表达的研究结果证实二者存在相关性，在宫颈鳞癌的发生及发展中叉头框C2蛋白及结肠癌转移相关因子均起到了重要作用[26]。有研究利用实时荧光定量PCR检测宫颈癌患者宫颈黏膜组织、同期收入的正常宫颈黏膜组织中叉头框C2蛋白、结肠癌转移相关因子及miR-216b表达水平，研究结果提示则将叉头框C2蛋白、结肠癌转移相关因子及miR-216b视作影响宫颈癌预后的独立危险因素，而在其研究进行了长期随访后表明可将叉头框C2蛋白作为宫颈癌的预后独立影响因素的范畴，可将叉头框C2蛋白作为评估该病患者手术治疗后康复过程中的一个重要参考指标[27]。而结合其他临床研究结果来看，结肠癌转移相关因子在COX比例风险模型分析中的影响因素较多，如年龄、性别、吸烟史、组织病理学、肿瘤直径、分化程度、化疗周期(P<0.05)等单因素都可能对叉头框C2蛋白预测预后效果造成干扰，而影响叉头框C2蛋白在宫颈癌患者预后表达的因素则只包括年龄、组织病理学、肿瘤直径等因素(P<0.05)；与此同时，叉头框C2蛋白可获取更准确的检测结果，其在借鉴既往研究(ROC曲线)的基础上将叉头框C2蛋白的临界值各设为3.22和123，这与另一个相关研究中的叉头框C2蛋白≥3.22≥123，显然相对接近[28]。在既往的研究中发现，结肠癌转移相关因子的临界值取值范围却相对较大，而叉头框C2蛋白的临界值取值较低，但既往研究中表明导致同样存在这种现象，而导致这种情况原因包括两类，一是可能宫颈癌处于不同病理因素状态有关，二是样本选取存在差异[27]。虽然叉头框C2蛋白在宫颈癌预后可能受很多因素的影响，但也不排除叉头框C2蛋白评估宫颈癌患者预后的价值，此外叉头框C2蛋白的临界值却与既往研究如Fan等[29]研究中的临界值较接近，故叉头框C2蛋白与宫颈癌预后有相关性。另外，有研究中的无病生存期(DFS)、总生存期(OS)的预后均受FOXC1(≥3.22)及年龄、叉头框C2蛋白、TNM分期、治疗反应等的影响，再次证实叉头框C2、C1蛋白是影响进展期宫颈癌预后的独立危险因素[30]。这样一来叉头框C2、C1蛋白又与N-cadherin、E-cadherin等转录因子有相关性，为了探讨到底叉头框C2、C1蛋白是不是真的影响进展期宫颈癌的预后，其临床研究采取ROC曲线分析发现，叉头框C2蛋白(AUC=0.605)的ROC曲线下面积较PLR(AUC=0.721)，可见后者与进展期宫颈癌的预后的相关性更显著。故结合既往研究[26,27]与本次研究来看，将叉头框C2蛋白作为影响进展期宫颈癌患者预后的独立危险因素更为恰当，而叉头框C1蛋白虽然也存在这种趋势，但相关性不显著，故需更多或更权威的研究数据提供佐证。而从另一个侧面来看，既往的口腔癌、卵巢癌、软组织肉癌、食管癌等的预后评估结果均证实，叉头框C1蛋白的预测价值较叉头框C2蛋白更低，这也在一定程度上为二者在进展期宫颈癌预后中的预测价值提供了借鉴依据。因此，将叉头框C2蛋白作为进展期宫颈癌预后效果好坏的判定依据和将其作为预测指标是可行的，但叉头框C1蛋白却需要更多的证据佐证才行。

2.3 FOXC2与子宫内膜癌 子宫内膜癌居发达国家女性恶性肿瘤首位，多见于绝经期女性，随着人口老龄化的加剧，其发病率及死亡率逐年上升。子宫内膜癌主要通过淋巴结转移，转移的重要步骤就是癌组织中淋巴管的生成。在正常的子宫中，淋巴管密度(LVD)值与子宫内膜相比，在子宫肌层较高。在子宫内膜腺癌中，癌组织内部的LVD明显低于正常子宫，而癌边缘的LVD却明显高于正常子宫[25]。FOXC2可在正常的子宫内膜的细胞质中表达，但在癌组织中高表达于细胞核与细胞质中，且FOXC2在子宫内膜癌上皮细胞及间质中的表达程度均明显高于正常内膜。FOXC2在正常内膜淋巴管中不表达，而在癌组织新生的淋巴管中明显表达，表明FOXC2主要是通过促进淋巴管的生成来参与子宫内膜癌的侵袭与转移，为子宫内膜癌的抗淋巴管生成治疗提供了理论基础。Jaskiewicz等[31]发现，糖尿病女性患子宫内膜癌的风险较正常女性增高了2～3倍，在糖尿病患者体内存在异常的β-N-乙酰氨基葡萄糖酰化(O-GlcN酰化)，这被认为是发病的关键因素，在子宫内膜癌细胞内同样发现了异常的O-GlcN酰化，它是通过FOXC2来诱导细胞发生EMT，从而促进癌细胞的侵袭与转移。FOXC2在子宫内膜中的应用目前还不够深入，这为之后的研究工作提供了更多的可能性。Ferlay等[32]研究中表明叉头框C2蛋白诱导后的细胞发生EMT,可有效阻断细胞凋亡机制，进而O-GlcN酰化，主要是依靠其促进淋巴管生成来的优势，促进肿瘤细胞不断增殖，并减少凋亡数量，此外在O-GlcN酰化的过程中抗凝血酶明显升高，与凝血酶活性密切相关的致癌机制也同样被触发，这是与叉头框C2蛋白促使肿瘤细胞恶性增殖的重要作用机制，同时伴有血管增生及肿瘤病灶所需的纤维沉淀。有研究表明，叉头框C2蛋白主要通过与P53相互拮抗发挥调节肿瘤细胞凋亡及细胞周期的作用，在针对p53靶基因启动子的研究过程中，发现高表达的叉头框C2蛋白可有效对抗P53原有的扼杀肿瘤细胞作用，通过将组织蛋白H3甲基化位点精氨酸转变为对肿瘤细胞有利的瓜氨酸，发挥阻断甲基化作用[33]。在有关研究中通过对叉头框C2蛋白的检测，相对于癌旁组织，叉头框C2蛋白在子宫内膜癌阳性率较高，且叉头框C2蛋白的表达水平随着子宫内膜癌临床分期增高而逐渐升高，这说明了叉头框C2蛋白具有预测子宫内膜癌患者发生与发展的价值[34]，其可辅助临床判断病情，为子宫内膜癌的临床治疗提供准确的参考依据，与宫颈癌的分期关系密切可用来作为靶向治疗因子，这有待临床研究进一步探查。此外临床针对宫颈癌的患者进行研究，表明可能叉头框C2蛋白与肌层浸润以及有无淋巴转移有关，在高中分化和临床早期均出现大量表达，宫颈癌的病理机制与慢性炎症有着密不可分的关系，肿瘤微环境的细胞因子在其中既发挥促进癌前病变与抑制肿瘤形成的双重作用[32]。党云等[35]研究中表明多数内皮细胞中的炎性因子均可强烈诱导叉头框C2蛋白进而使其大量表达抑制炎性反应和促淋巴血管形成，通过发挥诱导内皮细胞衰老、诱导凋亡、抑制增殖、侵袭以及转移等诸多作用。叉头框C2蛋白在内皮细胞中的作用与其抗肿瘤作用密切相关。首先从其生物活性的相关研究中可以得出叉头框C2蛋白在内皮细胞的生长分化等多个生理学效应中发挥了重要作用，虽然在通常情况下无法检测叉头框C2蛋白的具体表达，但其在细胞迁移、生长的过程中有重要功能可以在皮肤受到炎症刺激时表现，通过子宫内膜癌的研究中可以得出当身体组织受到炎性疾病等各类刺激时，叉头框C2蛋白会大量表达，内皮细胞会出现一些列生物学效应，尤其在有害药物刺激下叉头框C2蛋白可提高自身活性，利用过度表达缓解刺激造成的生理损伤。有研究显示叉头框C2蛋白的阳性率随着子宫内膜癌分期增加表达水平呈升高趋势，这证实了叉头框C2蛋白表达水平与肿瘤细胞的增殖调控以及肿瘤发生的关系密切，提示了叉头框C2蛋白对抑制肿瘤细胞转移降低致死率发挥了重要作用，佐证了通过监测不同时间段叉头框C2蛋白的表达进而采取相应手段干预预后值得实践的观点[36]。此外有关研究结果提示当叉头框C2蛋白表达且为阳性则预示着子宫内膜癌发生，提示叉头框C2蛋白、P53联合检查具有一定的相关性，可联合判断病情进展使临床依据更为准确[37]。子宫内膜癌的诊断方法较多，如B超检查、分端诊刮、宫腔镜检查、细胞学检查、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)及肿瘤标志物等，有关肿瘤标志物检查中，叉头框C2蛋白在子宫内膜癌早期一般不升高，但当病情发展到中晚期时，叉头框C2蛋白表达水平则会随之递增，而只要病情得到有效控制，其异常表达又会逐步恢复正常，因此临床上可将叉头框C2蛋白视作中晚期子宫内膜癌的肿瘤标志物，对病情进展和治疗效果的鉴定均有极大帮助。

2.4 FOXC2与卵巢癌 卵巢癌目前仍然是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，发达地区每年发病人数约23万，死亡人数约15万[38-40]。由于缺乏有效的筛查方法，且无典型的体征与症状，临床上发现时多已为晚期，目前治疗方法仍以手术结合放化疗为主，但其总体复发率高达 40%～60%，生存率<30%[41-43]。FOXC2可诱导卵巢癌细胞发生EMT，进而增强癌细胞的侵袭能力[44]。Zhou等[45]研究了4个不同的FOXC2基因位点，发现FOXC2基因的多态性与中国女性卵巢癌发病风险呈正相关。铂类药物目前仍然是卵巢癌化疗过程中的一线用药，如何降低癌细胞对铂类药物的耐药性也是临床上亟待解决的问题。孙厚良等[46]的实验表明，FOXC2在对顺铂(CDDP)耐药的卵巢癌细胞中的表达程度明显高于亲代卵巢癌细胞。此外，当敲除FOXC 2基因后，上皮标记物E-cadherin的表达增加，而间充质标记物(N-cadherin和Vimentin)和Snail的表达降低，意味着FOXC 2基因敲除可逆转CDDP耐药的卵巢癌细胞的EMT表型，而上调FOXC 2则可促进亲代癌细胞的EMT表型。由此可得，FOXC2是EMT在CDDP耐药性卵巢癌细胞中的启动子，通过对FOXC2及EMT表型的研究，可以为卵巢癌的治疗特别是提高其对化疗药物的敏感性提供潜在的临床新思路[47,48]。近年来，随着肿瘤标志物在恶性肿瘤的早期诊断中的应用价值逐渐体现出来，越来越多的标志物也被应用于各种癌症的判定指标之一，叉头框C2蛋白可诱导卵巢癌细胞发生EMT，这使得它在卵巢癌的早期诊断中逐渐成为可能[49,50]。将HE4、叉头框C2蛋白应用于卵巢癌及相关并发症诊断的案例在近几年的临床案例与实验中逐渐多了起来，如闵志雪[51]的研究证实，患卵巢癌淋巴结转移患者血清中的HE4和 CA125表达水平较单纯的卵巢癌(无淋巴结转移)者相比显著递增(P<0.05)，其受试者工作特征曲线(ROC)下的最佳临界点时，叉头框C2蛋白表达水平对卵巢癌伴淋巴结转移诊断的敏感度、特异度各47.27%和77.78%，而在ROC下的最佳临界点(40.69 kU/L)时，叉头框C2蛋白表达水平对卵巢癌伴淋巴结转移诊断的敏感度、特异度各23.40%和81.35%。有研究证实，卵巢癌组血清HE4和CA125表达水平较子宫良性疾病者、健康女性均更高(P<0.05)[52]。故将血清叉头框C2蛋白作为卵巢癌及相关并发症的诊断标志物之一可行，但对于二者在卵巢癌中的单独检测而言，其联合诊断价值应该更高。如有研究显示叉头框C2蛋白联合卵巢癌敏感度、约登指数、符合率、阴性预测值72.80%、0.639、83.70%及83.30%，较单独的叉头框C2蛋白诊断均大幅度提升，说明无论是绝经后卵巢癌患者还是非绝经卵巢癌患者，叉头框C2蛋白异常表达是既定事实[53]。

目前对FOXC2的研究与应用越来越深入，除了本文提到的妇科常见恶性肿瘤外，其他部位肿瘤中如胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、滋养细胞肿瘤及神经胶质瘤等均有涉及[54-60]。在细胞内通常具有多种转录因子或信号通路、多分子过程互相结合的特点[61]，为肿瘤的侵袭、浸润、转移及治疗效果、评估预后提供重要参考。此外，包括FOXC2在内的FOX蛋白家族为肿瘤耐药、靶向治疗等研究提供了理论依据。目前的研究已经明确了FOXC2参与细胞的增殖、分化、新陈代谢、迁移、凋亡等过程，促进新生血管及淋巴管的生成，并在多种类型的恶性肿瘤中异常表达[44]，与肿瘤的发生、侵袭、浸润、发展、耐药密切相关，但其详细作用机制及其与其他转录因子、信号通路之间的关系尚不明晰,在妇科恶性肿瘤中的应用不够广泛。我们希望伴随着更多的分子生物学及临床病理实验的研究，FOXC2能为妇科肿瘤的诊断及治疗提供更多新思路。