王素珍 张洁民

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是头颈部常见的恶性肿瘤，其早期症状不明显，病灶隐匿，患者就诊时多处于中晚期，治疗效果不理想[1,2]。因此，积极探究NPC发病机制，寻找可早期诊断、评估NPC预后的指标甚是关键。目前，研究认为，NPC发病与信号通路改变、炎性反应、环境因素、抑癌基因失活、EB病毒感染、癌基因激活等相关[3,4]。CC趋化因子受体6(CC-chemokine receptor 6,CCR6)是一种G蛋白偶联受体，其在肝细胞癌中表达上调，其可能通过影响癌细胞增殖、侵袭及血管生成，进而影响肝细胞癌发生发展[5]；p38是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的一员，其在NPC中表达水平升高，与肿瘤TNM分期显著相关，可作为评估NPC临床分期的潜在指标[6]；且CCR6可通过激活P38途径促进喉癌细胞转移及增殖[7]。而CCR6在NPC中的表达水平与p38的关系及二者与NPC预后的关系鲜有报道。本研究通过测定NPC患者癌组织CCR6、p38表达水平，旨在分析二者关系及其与NPC预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月至2017年9月我院收治的NPC患者91例进行研究，均符合按《鼻咽癌诊断和治疗》有关NPC判定标准[8]进行诊断。男54例，女37例；年龄37～70岁，平均年龄(54.75±11.28)岁；<55岁者43例，≥55岁者48例；淋巴结转移者49例，淋巴结未转移者42例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期者62例，Ⅲ～Ⅳ期者29例；低分化者35例，中、高分化者56例；有吸烟史33例，无吸烟史58例。受试对象及家属签署知情同意书，本研究符合《赫尔辛基宣言》，经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①患者符合NPC诊断标准，经术后组织病理检查/鼻内镜下活检明确诊断；②患者入院前未接受放化疗或其他抗肿瘤治疗；③患者具备完整检查资料。

1.2.2 排除标准：①合并严重感染性疾病、肝、肾、心等器官功能障碍者；②合并其他恶性肿瘤、失访者。

1.3 方法

1.3.1 组织标本收集:NPC患者进行根治性切除术时，留取部分NPC组织以及对应癌旁正常组织，0.9%氯化钠溶液清洗后，置于甲醛溶液中固定，制备石蜡标本切片，备用。

1.3.2 免疫组化法检测NPC组织、癌旁正常组织标本CCR6、p38蛋白表达情况：取石蜡组织切片(约3 μm 厚)，应用免疫组化SP法染色，操作步骤依据试剂盒说明书，一抗为兔抗人CCR6抗体(货号：ab78429，Abcam公司)、p38抗体(货号：gtx48614，Genetex公司)，二氨基联苯胺显色30 s，苏木素复染2～3 s，自来水洗10～15 min，蒸馏水洗，不同浓度乙醇脱水，封片，显微镜(型号：Ti2，日本尼康)下拍照。依据阳性细胞比例(A)与染色程度(B)评分乘积判断CCR6、p38蛋白表达情况，A：将阳性细胞比例<25%、25%～49%、50%～75%、>75%分别定义为0、1、2、3分；B：将染色程度无色、淡黄色、棕黄色、黄褐色分别定义为0、1、2、3分。CCR6、p38蛋白表达评估结果(A×B)：<3分为阴性，以≥3分为阳性。

1.4 随访 患者出院后进行3年随访，以门诊、微信、电话为主要随访方式，随访截至2020年9或NPC患者死亡，统计NPC患者生存情况。

2 结果

2.1 NPC患者组织中CCR6、p38蛋白表达情况 免疫组化结果显示，CCR6主要定位于细胞质/细胞膜，p38主要定位于细胞核。与癌旁正常组织比较，NPC组织CCR6、p38蛋白阳性表达率显著升高(P<0.05)。见图1、2，表1。

阴性表达 阳性表达

阴性表达 阳性表达

表1 NPC患者组织中CCR6、p38蛋白表达情况 n=91,例(%)

2.2 NPC组织CCR6、p38表达水平与临床病理特征关系 NPC组织CCR6、p38表达水平均与肿瘤淋巴结转移、TNM分期、分化程度明显相关(P<0.05)，与性别、吸烟史、年龄无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 NPC组织CCR6、p38表达水平与临床病理特征关系 例

2.3 NPC组织中CCR6表达水平与p38的相关性 Spearman等级相关性分析显示，NPC组织中CCR6表达水平与p38呈正相关(r=0.583，P<0.001)。见表3。

表3 NPC组织中CCR6表达水平与p38的相关性 例

2.4 NPC组织CCR6、p38表达水平与NPC患者预后的关系 对91例NPC患者进行36个月跟踪随访，死亡31例，总生存率为65.93%。CCR6阳性组NPC患者术后36个月总生存率为54.39%，明显低于CCR6阴性组生存率85.29%(χ2=9.058，P=0.003)；p38阳性组NPC患者术后36个月总生存率为54.55%，明显低于p38阴性组总生存率83.33%(χ2=8.028，P=0.005)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，CCR6阳性组NPC患者术后36个月累积生存率明显低于CCR6阴性组(χ2=8.002，P=0.005)；p38阳性组NPC患者术后36个月累积生存率明显低于p38阴性组(χ2=7.613，P=0.006)。见图3、4。

图3 癌组织CCR6表达水平与NPC患者预后的关系

2.5 NPC患者预后的影响因素 COX单因素分析显示，淋巴结转移、p38、TNM分期、CCR6是影响NPC患者预后的危险因素(P<0.05)，分化程度是影响NPC患者预后的保护因素(P<0.05)；多因素分析结果显示，淋巴结转移、p38、TNM分期、CCR6是影响NPC患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表4。

图4 癌组织p38表达水平与NPC患者预后的关系

表4 影响NPC患者预后因素的COX回归分析

3 讨论

NPC是一种源于鼻咽部黏膜的肿瘤，其发病率较高，随着放化疗的完善，NPC患者治疗效果虽有所提高，但不甚理想，对患者生存质量构成威胁[9,10]。因此，积极寻找与NPC发生发展，且可评估NPC预后的标志物，对及早诊断NPC、制定个体化治疗方案，改善患者预后有积极意义。

CCR6是CC趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)的受体，二者相互作用可促进肿瘤免疫逃逸、血管生成及细胞迁移、增殖、炎性反应[11-13]。研究发现，CCR6在结直肠癌中表达水平较高，其可能通过促进上皮间质转化进而在结直肠癌发展及肝转移中发挥促进作用[14]；另外，CCR6在肝细胞癌中呈高表达，与不良预后有关，其是影响肝细胞癌患者预后的独立危险因素，具有判断肝细胞癌患者预后情况的潜在价值[15]。以上研究表明，CCR6可能在多种肿瘤发病进展中起促癌作用。本研究中NPC组织CCR6蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织，提示CCR6可能与NPC发生发展有关，分析原因，一方面，高表达CCR6可能通过与其配体CCL20结合，激活炎性信号通路，促进血管生成，促进肿瘤发生，另一方面高表达CCR6可能与CCL20结合后，增加对NPC细胞迁移、增殖、上皮细胞间质转化的作用，调节巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞分泌细胞因子或逃逸[16]，从而促进NPC发展，但具体机制有赖深入探究。进一步探究显示，NPC组织CCR6蛋白表达水平与肿瘤淋巴结转移、TNM分期、分化程度相关，提示CCR6与NPC病情进展相关，可能在NPC发生发展中具有促癌作用。

p38是一种蛋白质，分子量为38 KDa，刺激因子可促进P38酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，P38被激活，促使P38进入细胞核，影响转录因子活性及细胞结构变化，调节信号通路有关基因转录、蛋白表达，在肿瘤血管生成、细胞生长、凋亡、分化、炎性反应等过程中发挥重要作用[17,18]。研究发现，p38在胰腺癌中呈异常表达，其可能通过影响血管生成、胰腺癌迁移、侵袭，从而影响胰腺癌发病进程[19]；另外，甘草查尔酮A可通过影响P38信号通路进而影响NPC细胞凋亡，P38可能在NPC病理发展中发挥重要作用[20]；且Farhat等[6]研究发现NPC患者P38呈过表达，具有判断NPC临床分期的潜在价值。以上研究表明，P38可能与NPC病变过程密切相关。本研究中NPC组织P38蛋白阳性表达率较高，提示P38可能在NPC中具有重要作用，推测P38过表达可能通过影响信号转导、细胞迁移、异常增殖、迁移、血管生成等过程进而在NPC发生发展中起作用，其机制有待结合基础研究证实。本研究显示，NPC组织P38蛋白表达水平随肿瘤淋巴结转移、TNM分期增高、分化程度降低而升高，提示P38与NPC疾病发展相关，测定鼻咽组织P38表达水平有助于确定NPC患者病情严重程度，确定治疗方案。

本研究中NPC患者癌组织中CCR6表达水平与p38呈正相关，提示CCR6可能与p38共同影响NPC病变进程，推测CCR6可能与CCL20结合，激活P38信号通路，影响NPC发生发展，但具体机制仍需深入探讨。进一步研究发现，CCR6阳性组、p38阳性组NPC患者术后36个月总生存率明显低于CCR6阴性组、p38阴性组，提示CCR6、p38与NPC患者预后相关，CCR6、p38表达水平越高，NPC患者预后可能越差，两者有望成为临床评估NPC患者预后的指标。另外，本研究发现，淋巴结转移、p38、TNM分期、CCR6是影响NPC患者预后的独立危险因素，提示淋巴结发生转移、TNM分期越高、CCR6、p38表达水平升高均可能会使NPC患者发生不良预后风险升高，及时测定鼻咽组织CCR6、p38表达水平可能有利于及早诊治、评估NPC预后。

综上所述，CCR6、p38在NPC患者癌组织中均呈高表达，两者均可能在NPC中发挥一定作用，且CCR6、p38可作为评估NPC患者预后的标志物。后期仍需深入探究CCR6、p38在NPC中的作用机制，为临床诊治NPC提供新靶点，增加说服力。