王凯 李伟伟 王佳

食管癌为临床常见消化道肿瘤，发病率呈现逐年升高趋势，其恶性程度高，死亡率高，食管癌的治疗手段主要为手术和放化疗，但患者预后不佳，5年生存率较低，因此，研究食管癌发生发展的机制对其临床治疗具有重要意义[1,2]。白头翁皂苷是从白头翁中提取的具有生物活性的天然产物，具有抗炎、抗肿瘤的作用，白头翁皂苷有多种有效单体成分，其中白头翁皂苷D(pulsatilla saponin D)具有抗多种肿瘤的作用[3]。王冰等[4]研究表明，白头翁皂苷D可通过调控Wnt信号通路而抑制宫颈癌细胞的增殖。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是细胞能量代谢的调节器，AMPK的激活可抑制人食管癌细胞的生长增殖，并可诱导细胞凋亡[5]。环氧合酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)作为一种诱导酶，在食管癌等多种肿瘤组织中表达水平升高，具有促癌的作用[6]。研究显示，吲哚类化合物GY3可激活AMPK并抑制COX-2的表达抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，并诱导其凋亡[7]。因此，本研究观察白头翁皂苷D对EC9706细胞凋亡及AMPK/COX-2通路的影响，初步探讨白头翁皂苷D对食管癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 白头翁皂苷D(纯度≥98%)购自南京春秋生物工程有限公司，人食管癌细胞EC9706购自中国科学院上海细胞库，AMPK抑制剂Compound C购自德国Merck公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)与DMEM细胞培养基购于美国Gibco公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购自Sigma公司；异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、p53、COX-2单克隆抗体及羊抗兔IgG单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人p-AMPKα、p-ACC多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；ELx800型酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 EC9706细胞培养与处理:EC9706细胞复苏后，将细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养，每隔48 h换液传代培养，待细胞至对数生长期时用于后续实验。取对数生长期EC9706细胞，使用浓度为5、10、20、40、80 μmol/L白头翁皂苷D处理细胞，对照组加入等体积的PBS缓冲液，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加10 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，37℃培养箱继续培养4 h，再加入DMSO溶液，于酶标仪波长490 nm处检测各孔吸光度(OD)值，绘制生长曲线，计算白头翁皂苷D的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.2.2 分组与干预:将对数生长期的EC9706细胞分为5组，分别为对照组(不做任何处理)，白头翁皂苷D(PSD)低、中、高剂量组，PSD高剂量+AMPK抑制剂(Compound C)组，PSD白头翁皂苷D低、中、高剂量组分别加入含终浓度10、20、40 μmol/L白头翁皂苷D的DMEM培养液，PSD高剂量+Compound C组使用40 μmol/L白头翁皂苷D与10 μmol/L Compound C共同处理细胞，各组细胞培养48 h，用于后续实验。

1.2.3 平板克隆形成实验:取各组处理的EC9706细胞，调整细胞浓度，以每孔1×103个细胞接种于6孔板中，于37℃条件下培养14 d，PBS洗涤后，使用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min，显微镜观察细胞克隆数，计算克隆形成率。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:取各组EC9706细胞，胰酶消化后，使用结合缓冲液binding buffer调整细胞浓度为2×105个/ml的细胞悬液，分别加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液混合均匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测EC9706细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blot法检测Bax、Bcl-2、p53、p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表达：各组处理的EC9706细胞培养48 h后，加入100 μl的RIPA裂解液，裂解30 min后取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%的BSA封闭1 h，分别加入稀释过的兔抗人Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、p53(1∶2 000)、p-AMPKα(1∶1 000)、p-ACC(1∶800)、COX-2(1∶2 000)单克隆抗体，室温孵育2 h，再加入HRP标记的二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，ECL试剂显色，以β-actin作为内参蛋白，SigmaScan Pro 5软件分析各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 白头翁皂苷D对EC9706细胞活性的影响 使用浓度为5、10、20、40、80 μmol/L白头翁皂苷D分别处理EC9706细胞24 h、48 h、72 h后，细胞存活率逐渐降低。经计算，白头翁皂苷D处理EC9706细胞48 h时IC50约为20 μmol/L，故后续实验中选择10、20、40 μmol/L的浓度作为后续实验用药剂量。见图1，表1。

图1 EC9706细胞增殖曲线

表1 不同浓度白头翁皂苷D处理后EC9706细胞活性

2.2 白头翁皂苷D对EC9706细胞克隆形成能力的影响 与对照组比较，PSD低、中、高剂量组EC9706细胞克隆形成率显著降低，并呈浓度依赖性(P<0.05)；与PSD高剂量组(85.47±4.25)%比较，PSD高剂量+Compound C组的细胞克隆形成率(113.35±3.94)%显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图2。

表2 白头翁皂苷D对EC9706细胞克隆形成率的影响

对照组 PSD低剂量组 PSD中剂量组 PSD高剂量组 PSD高剂量+Compound C组

2.3 白头翁皂苷D对EC9706细胞凋亡的影响 与对照组比较，PSD低、中、高剂量组EC9706细胞凋亡率显著升高，并呈浓度依赖性(P<0.05)；与PSD高剂量组比较，PSD高剂量+Compound C组细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表3。

对照组 PSD低剂量组 PSD中剂量组 PSD高剂量组 PSD高剂量+Compound C组

表3 白头翁皂苷D对EC9706细胞凋亡的影响

2.4 白头翁皂苷D对EC9706细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，PSD低、中、高剂量组EC9706细胞Bax、p53蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，并呈浓度依赖性(P<0.05)；与PSD高剂量组比较，PSD高剂量+Compound C组细胞Bax、p53蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图4，表4。

图4 5组EC9706细胞Bax、Bcl-2、p53蛋白表达;A 对照组；B PSD低剂量组；C PSD中剂量组；D PSD高剂量组；E PSD高剂量+Compound C组

表4 白头翁皂苷D对EC9706细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.5 白头翁皂苷D对EC9706细胞AMPK/COX-2通路相关蛋白表达的影响 与对照组相比，与PSD低、中、高剂量组p-AMPKα、p-ACC表达水平显著升高，COX-2蛋白表达显著降低，并呈浓度依赖性(P<0.05)；与PSD高剂量组相比，PSD高剂量+Compound C组p-AMPKα、p-ACC蛋白表达水平显著降低，COX-2蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5，图5。

表5 白头翁皂苷D对EC9706细胞AMPK/COX-2通路相关蛋白表达的影响

图5 5组EC9706细胞p-AMPKα、p-ACC、COX-2蛋白表达；A 对照组；B PSD低剂量组；C PSD中剂量组；D PSD高剂量组；E PSD高剂量+Compound C组

3 讨论

白头翁具有清热解毒、凉血止痢等功效，其提取物白头翁皂苷有A、B4、D、E等多种单体成分，具有抗炎、舒张血管、抗肿瘤等多种药理作用，在抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化与凋亡、抗血管生成活性、逆转肿瘤细胞耐药等方面发挥重要作用，对肝癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤具有体外抑制作用[8-10]。Zhu等[11]研究表明，白头翁皂苷E通过负调控Akt/FASN信号通路，抑制非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭和凋亡。邹晓静等[12]研究表明，白头翁皂苷A通过调控miR-24-3p/环指蛋白2抑制乳腺癌细胞的增殖，增强细胞的放射敏感性。

本研究结果显示，浓度为5、10、20、40、80 μmol/L白头翁皂苷D能显著抑制EC9706细胞活性，处理48 h 时IC50约为20μmol/L，故选择10、20、40 μmol/L的浓度进行后续实验。使用不同浓度白头翁皂苷D处理EC9706细胞后，EC9706细胞克隆形成率、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，EC9706细胞凋亡及Bax、p53蛋白表达水平显著升高，且呈药物浓度依赖性，表明白头翁皂苷D可显著抑制EC9706细胞增殖，促进细胞凋亡，然而其机制尚不清楚。

AMPK是调节能量代谢的酶，可调节细胞代谢与肿瘤进展，AMPK可以有效地促进肿瘤细胞发生凋亡，抑制细胞生长与迁移[13]。多项研究显示，AMPK与食管癌细胞的凋亡有关，激活AMPK可诱导食管癌细胞的凋亡[14]。另有研究显示，虫草素通过诱导AMPK的激活和抑制AKT信号通路来增强食管癌细胞对顺铂的化疗敏感性[15]。COX-2在食管癌等多种肿瘤中高表达，具有抗肿瘤细胞凋亡的作用，可通过AKT信号通路依赖的方式促进非小细胞肺癌细胞的上皮间质转化[16,17]。AMPK的激活可抑制COX-2的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，研究表明，熊果酸可通过调节AMPK/STAT-3/COX-2信号通路抑制乳腺癌细胞的生长、迁移与侵袭[18]。

本研究使用白头翁皂苷D处理EC9706细胞后，细胞中p-AMPKα、p-ACC蛋白表达水平显著升高，COX-2蛋白表达显著降低，并呈浓度依赖性，提示白头翁皂苷D可能激活AMPK通路，而抑制COX-2的表达。在白头翁皂苷D处理基础上加入AMPK抑制剂Compound C后，细胞存活率、Bcl-2蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率、Bax、p53蛋白表达水平显著降低，表明抑制AMPK通路可部分逆转白头翁皂苷D对EC9706细胞的增殖抑制作用和凋亡促进作用，进一步证实白头翁皂苷D具有激活AMPK通路的作用。因此推测白头翁皂苷D可通过激活AMPK通路，抑制COX-2表达进而抑制EC9706细胞增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，白头翁皂苷D抑制EC9706细胞增殖，促进其凋亡，可能与激活AMPK通路，抑制COX-2表达有关。但由于细胞内信号转导机制涉及通路复杂，其具体作用机制仍需做进一步研究。