张莹雪 孙凤霞 李晓玲

1.北京中医药大学研究生院 (北京， 100029) 2.首都医科大学附属北京中医医院感染科

肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理阶段[1]，其可以由任何原因的慢性肝损伤引起，最常见的原因是病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎。肝硬化的潜在机制尚不清楚，其发生和发展可能涉及多种类型的细胞、细胞因子和miRNA[2,3]。据统计，全世界每年约有100万人死于肝硬化并发症，肝硬化目前是全球第11个最常见的死亡原因，带来严重卫生经济负担[4]。肝硬化的治疗目前主要是病因治疗，抗炎抗肝纤维化，积极防治并发症[5]。研究发现，中医活血化瘀法有助于提高肝硬化治疗的临床有效性、改善患者临床症状、促进肝功能恢复[6,7]。下瘀血汤为《金匮要略》用于治疗妇人产后腹痛之方[8]，由大黄、桃仁、虫三味药物组成，方中大黄荡逐瘀血，桃仁活血化瘀，虫逐瘀破结，作为活血化瘀的基础方，临床加减用于治疗妇科产后恶露不尽、闭经、盆腔炎等多种瘀血相关病证。后代医家亦将此方用于肝炎及肝硬化患者有瘀血症状者，疗效显著[9,10]。越来越多的研究提示，下瘀血汤具有抗肝纤维化、防治肝硬化的作用[11]。然而，其作用机制尚不明确。本文拟运用网络药理学和生物信息学的方法，尝试从中药复方多靶点、多通路作用的角度，探讨下瘀血汤对肝硬化潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 下瘀血汤有效成分及靶点的获取 利用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分别检索大黄、桃仁,设置生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18。利用BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)，检索虫，设置“score cutoff”≥20，校正后P值<0.05，获取具有统计学意义的有效活性成分和基因。然后应用“PERL”软件对所获得的药物成分及作用靶点进行合并。应用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)校正靶点蛋白为规范的基因名称，整理得到下瘀血汤的有效成分及对应靶点数据信息。

1.2 肝硬化的相关基因的获取 以“cirrhosis”为关键词，分别从GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)、PharmGkb数据库(https://www.pharmgkb.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)对肝硬化相关基因进行搜索。应用R软件4.0.2中的“Venn”安装包以及脚本将结果取并集，绘制韦恩图。

1.3 获取潜在靶点 利用R软件将药物活性成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射，并绘制韦恩图，获得下瘀血汤活性成分的潜在治疗肝硬化作用靶点。

1.4 构建“药物活性成分-疾病靶点” 调控网络图 首先将1.1与1.2中最终获得的数据通过“PERL”软件以及脚本进行整理，然后应用 Cytoscape 3.8.0软件构建“药物成分-疾病靶点”的网络调控图。图中节点(node) 代表药物的活性成分或疾病与药物活性成分的关键靶点基因，靶基因节点大小代表与其相连中药化学成分的数目多少。在成分节点中，不同颜色代表成分来源于不同药物。用边(edge)来表示药物成分与疾病靶点之间的相互关系，节点的度(degree)是指网络中直接与该节点相连的边的数目，如果degree越大，则提示其参与生物功能越多。

1.5 蛋白质互作网络构建及核心基因筛选 将1.3中药物靶点与疾病相关基因交集文件导入STRING 数据库(https://string-db.org/)，设置物种条件为人，置信度>0.4，同时隐藏断开节点，构建蛋白互作网络(PPI)。将蛋白互作网络导入Cytoscape 3.8.0软件，应用插件CytoNCA对节点进行打分并过滤，打分基于点度中心度、中间中心度、接近中心度、特征向量中心性、网络中心性和局部边连通性等指标。筛选每个打分大于中位数的基因作为核心基因，并进行两次筛选，最终获得网络核心基因。

1.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 利用R软件对药物成分-疾病靶点文件进行ID转换，然后进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。其中GO分为生物过程(BP)、细胞组成(CC)、和分子功能(MF)三个模块[12]。将P值过滤条件及校正后的过滤条件均设为0.05，GO富集结果中富集最高的前10项和KEGG通路富集结果中富集最高的前30项以可视化图形表示出来。

1.7 GEO数据集靶点验证 下载GEO数据库芯片数据，数据集的编号为GSE77627，该数据集36例样本，其中22例为肝硬化患者样本，14例为对照组的样本。下载编号为GSE77627数据集的原始数据文件，包括其平台文件以及序列探针矩阵文件。利用平台注释文件对探针进行注释，将探针矩阵转化为基因矩阵。利用“PERL”软件将样本整理为两组，疾病组和健康组，对肝硬化患者组和健康对照组样本的表达，利用limma包计算基因表达差异的P值和表达Fold Change值，进而选取校正后P<0.05 且|log2FC|>1(2倍关系)作为筛选显著差异表达基因的阈值。利用“pheatmap”包将上调、下调最显著的差异基因各20个，进行绘制差异基因热图及火山图。

2 结果

2.1 下瘀血汤有效成分筛选与靶点预测 将筛选条件设置为OB≥30%，DL≥0.18，通过TCMSP数据库及BATMAN-TCM 数据库进行搜索共获得40个有效成分，其中大黄16个，桃仁23个，虫1个；同时共获得1 028个预测靶点(见表1)。将有效成分及靶点预测文件采用“PERL”软件及其脚本进行合并，然后应用Uniprot数据库及“PERL”软件进行标准化注释、删除无效及重复靶点，最终获得94个作用靶点。

表1 “中药-有效成分-疾病靶点”信息

2.2 肝硬化相关基因 通过GeneCard数据库、OMIM数据库、PharmGkb数据库、TTD数据库、DrugBank数据库分别获得肝硬化相关靶基因3 158、9、1、23和86个，经整理后共获得3 220个肝硬化相关靶基因。

2.3 药物靶点与疾病靶点基因交集 经过整理、分析共获得药物潜在活性成分靶点94个，疾病靶点3 220个，两者得出的交集基因为55个。

2.4 “活性成分-核心靶点”网络分析 在“活性成分-核心靶点”图中共有78个节点，其中来源于化合物的有23个，来源于基因的有55个(见图1)。经统计degree排前5的有效成分依次包括胆固醇(Cholesterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、泽兰黄醇素(eupatin)、常春藤皂甙元(hederagenin)，其来源分别为虫，桃仁、大黄，大黄，大黄，桃仁。

图1 “活性成分-核心靶点”网络图(圆形节点代表药物有效成分，不同颜色代表来自不同药物(虫-蓝色，大黄-红色，桃仁-紫色)，黑色线条代表边，蓝色方形节点代表中药与疾病共同的靶基因)

2.5 PPI蛋白互作网络及核心基因预测 将药物靶点与疾病靶点交集基因导入到STRING数据库中，以获得它们之间的相互作用关系，构建PPI网络。网络中的节点代表基因，不同的颜色代表不同的证据。同时将邻接节点数目排前30位的基因进行可视化表示，见图2，3。

图2 PPI蛋白互作网络

图3 邻接节点数目排前30位的基因

将TSV文件导入Cytoscape 3.8.0软件，网络拓扑结构筛选关键基因。第1次筛选条件分别为BC≥21.12，CC≥0.49，DC≥10，EC≥0.10，LAC≥4.57，NC≥5.33。第1次筛选结果共显示14个节点，74条边，得到14个核心基因。第2次筛选条件分别为BC≥1.98，CC≥0.84，DC≥10.5，EC≥0.27，LAC≥8.4，NC≥9.7。第2次筛选结果显示5个节点，10条边，得到5个核心基因，分别是PTGS2、CASP3、MYC、TP53、JUN。见图4。

图4 PPI网络拓扑分析核心基因

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 经过GO富集分析(图5)共得到1 713条富集结果，其中生物过程(BP)1 561个，主要涉及对类固醇代谢及合成、维生素生物代谢及合成、DNA模板转录起始、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始等进行调节；细胞组分(CC)32个，主要涉及膜筏、膜微区、膜区等细胞组分等；分子功能(MF)120个，主要涉及配体激活、转录因子活性、核受体活性、DNA结合转录因子结合、类固醇结合等。经过KEGG通路富集分析(图6)共得到113条通路富集结果，涉及p53信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、细胞凋亡、神经变性的途径-多种疾病、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。提示下瘀血汤可能通过以上通路发挥对肝硬化的治疗作用。

图5 GO富集分析

图6 KEGG通路富集分析

2.7 作用靶点的验证结果 根据方法学部分所述，下载GSE77627数据集，经过筛选一共获得差异基因8 184个，例如MIR128-1、SNORD117、SNORD110、SNORD35B、NORD61等，其中上调基因4 057个，下调基因4 127个，GEO数据库差异热图见图7，其中红色为高表达，黑色为中间表达，绿色为低表达。差异基因的火山图见图8，黑色点代表在试验组和正常组没有差异的基因，绿色点代表在正常组上调的基因，红色点代表在试验组上调的基因。将所获得的差异表达基因与下瘀血汤对肝硬化的潜在作用靶点互相映射，交叉验证取交集获得18个共有靶基因，分别是：ADH1C、CASP3、DRD1、AR、KDR、CA2、MED1、NR3C2、JUN、ESR1、PRKCA、ESR2、NOS2、NR1H4、GFI1、VDR、CYP27A1、SLC6A3，可能为下瘀血汤治疗肝硬化的潜在关键靶基因。

图7 GEO数据库差异热图

图8 差异基因的火山图

3 讨论

本研究以网络药理学及生物信息分析学为基础，对下瘀血汤进行了分析，为其多成分、多靶点、多途径的作用机制研究提供了参考。

本研究发现下瘀血汤中关键化合物主要为Cholesterol、beta-sitosterol、aloe-emodin、eupatin、hederagenin等活性成分，发挥治疗作用的5个关键靶点为PTGS2、CASP3、MYC、TP53、JUN。PTGS2参与了肝纤维化的主要发病机制，例如炎症、凋亡和细胞衰老。此外，在患有非酒精性脂肪肝或肝硬化的患者和动物模型中，PTGS2呈异常表达。这些发现表明，PTGS2在肝纤维化的发展中具有广泛而关键的作用[13]。Caspase分子在炎症以及凋亡过程中起重要作用。研究发现随着炎症程度的增加，TRAIL表达显著降低，而随着晚期肝纤维化、肝硬化的发生，CASP3的表达显著增加[14]。促凋亡信号激活启动半胱天冬酶，进而激活效应半胱天冬酶，例如CASP3，半胱天冬酶的顺序激活导致底物蛋白的切割和DNA分子的分解，进而导致细胞凋亡，CASP3在凋亡机制中起着核心作用[15,16]。MYC是一种神秘的癌基因，因为它似乎影响所有的细胞过程，最突出的是细胞代谢和核糖体生物发生。MYC触发选择性基因表达扩增，以促进细胞生长和增殖。MYC通过其目标协调营养物质的获取，以产生ATP和关键的细胞构建模块，这些模块增加细胞质量并触发DNA复制和细胞分裂[17]，有研究表明C-myc的表达与肝硬化的发生、发展密切相关[18]。p53蛋白阻止应激细胞分裂或导致它们经历程序性细胞死亡。p53蛋白被认为是细胞应激的保护者，已经被广泛研究，并且被确定为肿瘤抑制因子。然而，对p53在肿瘤抑制以外的其他作用知之甚少。值得注意的是，最近的报告证明p53参与了某些类型肝细胞损伤的分子机制[19]。转录因子JUN是肝脏再生的核心基因，也是潜在的治疗靶点，未来需要对肝再生进行系统的研究，以更好地确定潜在的机制[20]。

为了进一步探讨和验证靶点预测的准确性，从GEO下载肝硬化相关的基因芯片数据，筛选肝硬化患者和健康对照组之间的差异表达基因：例如MIR128-1、SNORD117、SNORD110、SNORD35B、NORD61等，可作为肝硬化的潜在靶基因，之后与网络药理学研究结果比对，获得18个共有靶基因：ADH1C、CASP3、DRD1、AR、KDR、CA2、MED1、NR3C2、JUN、ESR1、PRKCA、ESR2、NOS2、NR1H4、GFI1、VDR、CYP27A1、SLC6A3；这些潜在靶点可能为下瘀血汤主要活性成分治疗肝硬化的潜在关键靶基因。

本研究发现核心基因的GO功能富集主要涉及类固醇代谢及合成、维生素生物代谢及合成、DNA模板转录起始、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录起始等生物过程，这些基本生物学过程和功能体现在下瘀血汤活性成分调节对应靶基因和具体通路过程中。关于KEGG通路富集，主要包括涉及p53信号通路、乙型肝炎、丙型肝炎、细胞凋亡、神经变性的途径-多种疾病、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。其中细胞凋亡是肝损害分子机制中的第一个细胞反应，研究表明，有的中药提取物可显著减少细胞中细胞存亡调控蛋白(CASP3等)的表达，抑制细胞凋亡，从而进一步减少肝细胞坏死，减缓肝纤维化进程，阻断肝细胞凋亡途径[21]。NF-κB是一类机体内参与免疫、炎症反应，维持细胞功能的基因转录调控因子，可调节细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子等多种物质的表达，与免疫应激、细胞增殖、生长分化、细胞周期及凋亡有密切联系，可以阻止肝星状细胞(HSC)凋亡和促进HSC存活与增殖。MAPK信号通路能够通过HSC活化、增殖、凋亡以及细胞周期参与肝纤维化的形成与逆转[22]。

综上所述，本研究采用网络药理学和生物信息学方法研究下瘀血汤治疗肝硬化的作用机制，发现下瘀血汤能够通过多成分、多靶点、多种生物途径及多条通路达到治疗肝硬化的目的，为进一步从下瘀血汤中提取有效活性成分治疗肝硬化提供了理论依据。鉴于网络药理学和生物信息学存在一定的局限性，有待进一步设计严格的动物实验及临床试验验证其作用机制。