张亿清，李 娟，戚南山，吕敏娜，吴彩艳，林栩慧，胡俊菁，蔡海明，肖文婉，张健騑，廖申权，孙铭飞

（1.仲恺农业工程学院，广州 510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 农业农村部兽药与兽医生物技术学科群广东科学观测实验站 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广州 510640）

自噬又被称之为程序性细胞死亡（Ⅱ型），是存在于所有真核生物中的一种进化保守的细胞自降解过程，细胞质中受损细胞器或变性的大分子连同胞浆被双层囊泡包裹形成自噬体，自噬体再与溶酶体结合形成自噬溶酶体，在溶酶体中多种酶的作用下降解成小分子回到胞浆重复利用。根据底物运送到溶酶体的方式不同，自噬可分为三种类型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导自噬（chaperone-mediated autophagy）[1]。细胞在正常生长发育中离不开自噬的作用，一方面，自噬可把细胞中受损或过剩的物质降解回收，维持细胞稳态；另一方面，自噬可以应对多种胁迫条件，当细胞遭受病原微生物如寄生虫、病毒、细菌等入侵时，细胞可通过诱导自噬启动对微生物的防御作用进而清除病原[2]。

顶复门原虫隶属单细胞真核生物，常见的有刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）、疟原虫（Plasmodium spp.）等，是引起人和动物重要寄生虫病的一类病原，它们都有着相似的亚细胞结构和保守的入侵机制。研究发现，顶复门原虫入侵宿主细胞时，宿主细胞可通过自噬将其清除；同时，顶复门原虫亦可以逃逸宿主细胞自噬的天然防御作用，并利用自噬这一过程为自身的生长发育提供能量[3-4]。

1 自噬的形成及分子调节

自噬是一个动态的过程，可人为的把这个过程分解为一系列连续的步骤，主要有四步：细胞在接受自噬诱导信号后，在胞质中形成自噬前体结构（pre-autophagosomal structure,PAS），PAS进而招募其他自噬相关基因（autophagy associated gene,ATG）蛋白进行定位； PAS在ATG蛋白的调控下不断扩展、延伸；双层囊泡包裹着胞浆成分形成自噬体；自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在溶酶体腔室水解酶的作用下胞浆成分分解成小分子物质并释放到胞内循环利用。自噬是一个严格调控的分解代谢过程，大约受到18个核心基因蛋白的调控，主要包含以下5种复合体：

1.1 ULK1-ATG13-FIP200复合体 LK1（酵母ATG1同系物）、FIP200（酵母ATG17同系物）、ATG13三种蛋白形成的ULK1复合物是连接自噬信号通路上游MTOR和AMPK与下游自噬体形成的关键桥梁，也是唯一具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的自噬核心蛋白[5]。

外界营养充足的情况下，MTOR被激活，活化的MTOR能够高度磷酸化ATG13，磷酸化后的ATG13降低与ULK1的亲和力，导致自噬被抑制。外界营养不足时，受能量调控的信号AMPK可直接抑制MTOR，或经TSC1/TSC2途径抑制Rheb活性间接抑制MTOR，此时抑制性MTOR依赖的磷酸位点上的ATG13发生去磷酸化，磷酸化水平降低的ATG13与ULK1和FIP2OO结合 能力增强，从而诱导自噬。ULK1对自噬的诱导过程是基于其激酶活性还是通过ULK1复合物的功能目前还存在争论。研究发现，当细胞中缺乏ULK1时，ATG13与FIP200可以相互作用，当ATG13缺失时，ULK1与FIP200不能直接作用，表明ATG13介导ULK1与FIP200相互作用[6]。

1.2 磷脂酰肌醇-3-激酶复合物（Ⅲ型PI3K） 哺乳动物中的PI3K有两种类型：Ⅰ型PI3K和Ⅲ型PI3K。Ⅰ型PI3K在胰岛素或生长因子的刺激下将底物PIP2转化成PIP3，PIP3再通过胰岛素信号通路激活PKB和MTOR，从而抑制自噬。Ⅲ型PI3K复合体在自噬体的形成中起诱导膜延伸、扩展的作用。Ⅲ型PI3K复合体定位于自噬前体结构上（proautophagosome,PAS），可结合膜成分，使脂质分子中的磷脂酰乙醇（phosphatidylinositol,PI）磷酸化为PI3P、PI3P进而再招募与其相结合的蛋白到双层膜上包括ATG18、ATG21、ATG12-ATG5-ATG16多聚体及LC3等。

Ⅲ型PI3K在细胞内形成两种复合体：PI3K复合体Ⅰ和Ⅱ，两种复合体包含3种共同组分：VPS34（Ⅲ型PI3K的一种）、ATG6（哺乳动物同系物Beclin1）、VPS15，都包含一种特有成分ATG14或VPS38，目前认为它们在ATG6与VPS34-VPS15中起连接作用，复合体Ⅰ才与自噬相关[7]。

PI3K复合体Ⅰ中的ATG6是自噬调控的核心蛋白，Beclin1是哺乳动物中 ATG6的同系物，包含三个结构域：BH3（Bcl-2-homology3）、中央螺旋区（central coiled-coil domain,CCD）和进化保守区（evolutionarily conserved domain,ECD）。VPS34能够与Beclin1的ECD结构域结合，形成Beclin1-VPS34复合物，促使磷脂酰乙醇（phosphatidylinositol,PI）磷酸化成PI3P，招募其他蛋白定位于双层膜上。UVRAG（VPS38同系物）可以与Beclin1的CCD结构域结合，从而提高PI3K的活性[8]。Bcl-2/Bcl-XL含有BH3受体，它们可以与Beclin1竞争受体，从而抑制自噬的进程。

1.3 ATG9跨膜系统 关于自噬体膜脂质的来源一直存在争论，目前普遍认为该脂质来源于粗面内质网。ATG9是自噬体形成的膜整合蛋白，被认为是组装过程中的膜载体，负责从外周位点运送脂质成分至PAS上组成自噬体膜[9]。自噬发生时ATG9不断地在PAS与外周位点运转，当自噬体成熟时，ATG9没有整合至自噬体上，而是以游离的状态重回胞浆。

ATG9从外周位点携带脂质成分运送至PAS过程称为顺行运输，该过程需要其他蛋白一起协助进行。ATG23是外周膜蛋白，ATG27是Ⅰ型跨膜蛋白，在顺行运输过程中两者与ATG9组成异源三聚体复合物，一起移动至PAS上。ATG9被顺利运送到PAS上还需要肌动蛋白细胞骨架的参与，肌动蛋白细胞骨架遭到破坏时ATG9也不能被运送到PAS上。肌动蛋白相关蛋白Arp2是肌动蛋白纤丝成核因子Arp2/3复合物的一个亚基，与ATG9相互作用并靶向PAS提供动力，ATG11介导ATG9与Arp2/3的结合，促使Arp2/3推动ATG9从外周位点运送到PAS上。

ATG9从PAS上回到外周位点称为逆行运输，该过程需要多种蛋白的协助，包括ULK1复合物、ATG2、ATG18、Ⅲ型PI3K复合物Ⅰ等，缺少任何一种蛋白，都会导致ATG9滞留在PAS上。ATG23和ATG27的回收需要依靠ULK1复合物的激酶活性，ULK1复合物能够促进ATG2和ATG18与ATG9的结合，这种结合的复合物促使ATG9从PAS上回到外周位点进行下一轮的脂质运输。

1.4 ATG12-ATG5-ATG16和ATG8-PE两种泛素样途径 自噬体双层膜在延伸过程中包括两种泛素化途径：ATG12-ATG5-ATG16复合物和ATG8-PE复合物，两者驱动双层膜的延伸和弯曲。

ATG12的C末端甘氨酸与泛素E1样酶ATG7的活性半胱胺酸位点结合形成一个脂硫键导致ATG12活化，活化的ATG12在E2样酶ATG10的作用下通过甘氨酸与ATG5内部的一个赖氨酸残基结合，形成一个异源二聚体，随后再与ATG16结合形成四聚体复合物[10]。ATG12-ATG5-ATG16复合物定位于自噬体双层膜的外侧，驱动膜的弯曲延伸，并在双层膜闭合前后释放回胞浆中[11]。

另一种泛素样系统是ATG8与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl elthanolamines,PE）结合形成ATG8-PE复合物。早期形成的ATG8没有活性，其C末端精氨酸被ATG4水解切割暴露出甘氨酸。随后ATG8的甘氨酸与E1样酶ATG7的半胱氨酸结合被活化，再与E2样酶ATG3结合，最终在ATG12-ATG5-ATG16复合物的作用下，ATG8与PE结合形成ATG8-PE复合物，也称为LC3-Ⅱ[12]。ATG8-PE复合物定位于双层膜两侧，位于内测的ATG8-PE随着自噬体运送到溶酶体中被降解，位于外侧的ATG8-PE复合物被ATG4切割，使ATG8从膜上分离，重回胞浆[13]。

2 自噬的信号传导

细胞中自噬的诱导或抑制受到多种因素的刺激，例如营养、能量、生长因子、药物或辐射等。不同因素刺激自噬的信号通路不一样，已知有多种信号通路汇聚于进化保守的雷帕霉素靶点（target of rapamycin,TOR），通过TOR酶活性调节细胞自噬，也有一些信号通路不依赖TOR发挥作用。

2.1 依赖于TOR激酶的信号通路 TOR是细胞内一种结构和功能高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，目前已知在315种真核生物中鉴定出TOR基因[14]。哺乳动物中（mechanistic target of rapamycin,MTOR）主要存在于两种复合物中：mTORC1和mTORC2，而与自噬相关的mTOR存在于mTORC1复合物，并且mTORC1是药物雷帕霉素已知的唯一靶点，由四种蛋白组成，分别为mTOR、MLST8（也称为GBL）、PRAS40以及Raptor（mTOR调节性相关蛋白）。mTORC1的活性可通过整合多种信号通路进行调节，其中最主要的是PI3K-AKT和AMPK。

2.1.1 PI3K-AKT信号通路 PI3K-AKT通路是自噬传导中研究最深入的信号通路，对自噬起到抑制作用。Ⅰ型磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B,PI3K）的活化多依赖存在于质膜内测的底物生长因子。活化的Ⅰ型PI3K使PIP2磷酸化成PIP3，PIP3再与含有PH结构域的蛋白PDK1结合，促使PDK1磷酸化AKT，AKT抑制GTP酶激活蛋白复合物TSC1-TSC2，导致Rheb-GTP稳定，这将活化MTOR并抑制细胞自噬。MTOR和PDK1均可以活化核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase,S6K）[15]，在营养条件下，S6K可直接诱导自噬，或通过抑制Ⅰ型PI3K间接诱导自噬，以维持在营养条件下的基础自噬。在营养缺乏条件下，MTOR可抑制S6K引起的自噬，防止自噬过度。

2.1.2 AMPK信号通路 AMPK通路是细胞受到能量胁迫条件下诱导自噬产生能量的信号通路，当细胞中ATP水平急剧下降时，肝肌酶B1（liver kinase B1,LKB1）对AMPK的活化，活化的AMPK可通过诱导结节硬化症复合物TSC1-TSC2的活化来抑制MTOR，从而诱导自噬。AMPK也可通过磷酸化并稳定细胞周期蛋白激酶抑制因子P27蛋白，导致自噬活化。

2.2 不依赖TOR的信号通路 在细胞中亦含有多种信号通路独立于TOR蛋白来调节自噬，它们在细胞应对各种胁迫条件时发挥重要作用。真核翻译起始因子2α激酶（eukaryotic translation intiation factor 2,EIF2α）在哺乳动物中含有四种类型：HR、GCN2、PKR和PERK，它们可分别在亚铁血红素缺乏、饥饿、病毒感染和ER胁迫条件下激活自噬；死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）家族包含三个密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分别为DAPK、ZIPK和DRP-1，这三种蛋白可组成多蛋白复合物，应对多种细胞胁迫来诱导细胞凋亡和自噬性的细胞死亡；JNK蛋白可通过磷酸化抑制Bcl-2家族成员与Beclin结合，导致Beclin从Beclin-Bcl-2复合物中脱离，进而诱导自噬[7]。

3 自噬通路在顶复门原虫入侵发育中的作用

自噬除了能够维持自身稳态之外，在细胞遭受外界胁迫条件时也发挥重要作用[16]，如当细胞遭受寄生虫感染时，自噬可以把寄生虫包裹运送到溶酶体进行降解。研究也发现，在自噬清除寄生虫时，寄生虫似乎也能够对抗宿主的自噬机制，甚至利用宿主细胞的自噬为自身发育提供能量[17]。近年来，关于顶复门原虫感染引起宿主细胞自噬的研究越来越多，尤以弓形虫和疟原虫为主。

3.1 弓形虫 弓形虫属于顶复门原虫，可侵入任何有核细胞，对人和动物产生极大的危害。弓形虫侵入宿主细胞后，可在细胞内产生纳虫空泡（parasitophorous vacuole,PV）、纳虫空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）部分成分来源于宿主细胞，可使弓形虫免受宿主细胞免疫清除。在哺乳动物中，IFN-γ在清除弓形虫感染中起着重要的作用，也可以触发多种途径抵抗弓形虫，包括诱导抗菌分子一氧化氮、活性氧和营养缺乏等，其中最重要的是免疫相关GTP酶（immunityrelated GTPase,IRG）（啮齿动物特有的GTPase）和鸟苷酸结合蛋白（Guanylate-binding protein,GBP），这些蛋白能够破坏弓形虫或者限制弓形虫生长[18]。

在小鼠细胞模型中，弓形虫进入宿主细胞形成PV，随后IRG聚集到PVM上导致膜破裂，弓形虫暴露在细胞质中最终被宿主细胞自噬所清除。在早期对EPV病毒的研究中发现了自噬蛋白LC3能够招募IRG蛋白[19]，在LC3脂化结合PVM的过程中涉及到几种自噬蛋白，如ATG5、ATG12和ATG16等，这几种蛋白对IFN-γ诱导的IRG结合到PVM中也起很重要的作用[20]。例如在缺乏ATG5的情况下，IRGA6、IRGB6和IRGD等蛋白聚集在宿主细胞质中[21]。在缺乏LC3同系物Gabarap、Gabarapl1和Gabarapl2（Gate-16）的情况下，IRG靶向PVM的能力降低，再将ATG12-ATG5-ATG16L1复合体重新定位到其他膜上，会导致IRG聚集到其他膜上而不是PVM[22]。但是，如果缺乏ULK1、ATG9或ATG14等诱导自噬的上游蛋白并不会影响IRG靶向PVM和清除弓形虫。表明这种机制诱导的自噬并不是典型自噬。

不同细胞对弓形虫的处理方式不一样，小鼠细胞是通过IRG破坏PVM导致弓形虫死亡，但人类细胞不表达IRG，而是以泛素为靶向，通过LC3招募P62、NDP52、GBPS等结合在PV上，在PV周围形成自噬膜包裹着PV，从而限制弓形虫生长。GBPS还可以通过介导一种被称为焦亡的宿主细胞死亡的程序化形式清除弓形虫，GBPS介导弓形虫的PAMPS暴露于细胞质PRR中，通过激活半胱天冬酶-1（Caspase-1）使宿主细胞膜上形成孔隙，最终导致细胞死亡[23]。

CD40介导的弓形虫清除作为IFN-γ介导途径的一个补充机制，可诱导完整的自噬来清除弓形虫。弓形虫进入细胞并形成纳虫空泡，CD40刺激自噬复合物如ULK1、Ⅲ型PI3K复合物等，并招募LC3定位于自噬体膜上包裹着PV，运送到溶酶体上并与之结合，从而清除弓形虫[24]。

宿主细胞通过自噬来清除寄生虫，同时，寄生虫也可以通过调节宿主细胞自噬为自身生长提供条件。在PV中的弓形虫可通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）介导的信号通路来阻止自噬机制对弓形虫的靶向作用[25]。在HeLa细胞中，弓形虫在细胞中可诱导大量的自噬体形成，利用宿主细胞自噬产生的能量来维持自身生长[26]。最近的研究也发现，感染弓形虫的细胞会发生脂滴自噬，从而为弓形虫的发育提供脂肪酸来源[27]。总的来说，弓形虫感染细胞引起宿主细胞自噬，自噬又可以反过来促进弓形虫的发育。

3.2 疟原虫 疟原虫经蚊子传播进入哺乳动物体内先后在肝细胞和红细胞内发育，由于成熟红细胞没有细胞器，故疟原虫在红细胞内不引起宿主细胞自噬行为，而在肝细胞内，宿主细胞的自噬对疟原虫的发育具有重要影响[28]。

伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）侵入肝细胞后，肝细胞通过识别孢子体表面6-半胱氨酸结构域蛋白P36等在细胞质中形成PV，将疟原虫包裹起来[29]。随后PV迅速招募LC3及其结合蛋白P62、NBR1、NDP52等蛋白结合到PV膜上，LC3的功能之一是将结合受体靶向溶酶体，导致PV在溶酶体中降解，这一过程类似于选择性自噬[30]。与其他已知的自噬形式相比，肝细胞自噬清除疟原虫的反应有几点不同的特点。首先，典型自噬反应涉及到自噬膜的产生，由自噬膜包裹着需降解的底物形成自噬体，而PVM上的LC3修饰并不涉及新膜的产生。其次，典型自噬中自噬体形成后随即与溶酶体结合，降解内容物，而PVM则被溶酶体包围，不容易与溶酶体融合。第三，LC3与PVM的结合是暂时的，在疟原虫发育后期，LC3通过泡状网络（tubovesicular network,TVN）从PVM中吸取出来释放到细胞浆中，LC3与PVM的分离是疟原虫的发育所必须的条件[31]。第四，LC3结合到PVM中依赖于LC3的脂化，表明典型自噬中LC3泛素化途径中涉及到的ATG蛋白也参与此过程，但其并不需要ULK1等自噬起始物。基于以上几个特点，肝期疟原虫发育可能是一种非典型自噬形式，这种反应被称为疟原虫相关自噬样反应PAAR[32]。

不同疟原虫引起宿主细胞产生的免疫反应也不相同。间日疟原虫（plasmodium vivax）感染肝细胞后需要额外的IFN-γ刺激来识别和清除寄生虫，其机制与LC3样相关自噬（LAP）相关。IFN-γ介导的反应依赖于PI3KC3的成员Beclin 1、泛素结合系统等促进LC3-PE结合到PVM中并导向溶酶体融合，进而清除疟原虫。

为了能够在宿主细胞中更稳定地生存，疟原虫也进化出可以抵抗宿主细胞免疫清除的分子机制。伯氏疟原虫感染肝细胞后被PVM包裹，PVM来源于宿主细胞，却可以被疟原虫广泛修饰，将其蛋白质插入到PV膜上[33]。因此，这些蛋白质中将有可能改变PVM的功能以破坏宿主细胞对疟原虫的防御。在目前发现的这些少数蛋白中，UIS3对疟原虫的肝期发育影响最大。UIS3缺失的疟原虫感染宿主细胞后不能继续发育并很快被自噬清除，但感染自噬缺陷的宿主细胞时，疟原虫能正常生长[34]，表明UIS3蛋白对宿主细胞自噬清除产生抑制作用。疟原虫蛋白UIS3通过与PV膜上的LC3结合调控宿主细胞自噬，这一证据来源于在GFP-LC3稳定表达的HeLa细胞中，UIS3-myc疟原虫感染宿主细胞后发现 GFP-LC3与UIS3相互作用，并且在对UIS3-LC3交界面结构研究中发现UIS3上存在能与LC3结合的重要氨基酸残基[35]。UIS3通过竞争性地与LC3非经典的LIR基序结合，阻断LC3与其他目标蛋白P62、NDP52、NBR1的泛素结合，从而对宿主的自噬机制产生抑制。

与伯氏疟原虫研究观察到的逃避策略相反，肝期间日疟原虫通过避免选择性识别而逃避宿主的自噬机制。间日疟原虫PVM上的LC3标记由IFN-γ诱导，以IFN-γ介导的LAP清除为目标的寄生虫通常无法逃避细胞内免疫反应。这可能与间日疟原虫独特的肝休眠期相关，推测间日疟原虫可能通过干扰IFN-γ信号通路来阻止自噬反应的发生。

宿主细胞内典型的自噬能够为疟原虫的发育提供营养。研究发现，对饥饿小鼠和正常小鼠同时感染等量疟原虫，饥饿组疟原虫的数量是正常组的20倍以上[28,36]，基于这个现象，推测宿主细胞中可供执行自噬的分子供应数量有限，如果一个饥饿的细胞被额外感染，典型和非典型自噬途径会竞争共同的自噬成分。为了生存，被感染的细胞似乎优先于典型的自噬产生营养。根据这一假设，寄生虫可以更容易地在饥饿的细胞中建立感染，从饥饿细胞中获取由典型自噬提供的营养进而维持生长。

4 小结与展望

宿主细胞自噬一方面可以清除进入胞内的寄生虫，另一方面又可为其发育提供营养，不同寄生虫感染宿主细胞引起的自噬通路作用方式及途径不一样，甚至同一种寄生虫感染不同宿主细胞引起的自噬现象也不完全一样。关于顶复门原虫与宿主细胞自噬的相关机制研究目前主要集中在少数种类的寄生虫，研究的深度和广度仍需进一步扩展，如寄生虫引起宿主细胞自噬信号通路、寄生虫本身自噬对入侵宿主细胞的活力等。从自噬角度研究胞内原虫与宿主细胞的互作机制，解析并挖掘重要的作用分子，对该类疾病的防控将会是一个很好的突破点。