陈爱平 ,张拥军

自2019 年冠状病毒病(COVID-19)大流行疫情暴发以来,国内外研究团队、体外诊断试剂企业陆续推出了大量与SARS-Co V-2 相关的实验室检测方法,并在实践中随着疫情的发展不断得到完善、更新[1-4]。近两年的疫情防控经验证明,大规模检测的策略应用于疑似感染者诊断、临床患者管理、传染源调查、隔离检疫措施、感染预防控制、密切接触者管理和重点人群筛查等方面,可以有效阻断病毒的传播和疫情的蔓延[1-3]。

实验室检测SARS-Co V-2 的直接证据是在待检样品中检出SARS-Co V-2各种病毒相关成分,包括病毒颗粒、病毒特异抗原、病毒RNA 片段或序列,间接证据则是在患者血液中检出不同的SARSCo V-2病毒特异性抗体。这些检测涉及多种检材,包括来自疑似感染者的各种样品(呼吸道拭子、唾液、痰、支气管灌洗液、血液、尿、粪便等)和死亡病例的尸检组织,各类动物样品以及来自外环境的污水、气溶胶、物品表面拭子等[3-6]。尽管不同检测方法依据的实验原理和操作平台迥异,迄今为止已经在多种样品中确认检测到上述SARS-Co V-2 病毒相关成分,包括来自感染者的生物样品(拭子、体液、组织)、感染者接触或污染过的物品及外环境表面、陪伴动物(猫、狗)、饲养动物(虎、狮、水貂)、生活污水等[3-7]。这些病毒相关成分的有无并不足以确定样品中是否存在能够复制、有感染性的病毒。准确区分哪些样品中存在无复制能力、无感染风险的病毒成分,哪些样品中存在能够复制、有感染性的病毒,不仅有助于充分认识可能存在的传染来源和传播途径,而且能够促进修订和落实疫情防控措施,更加有效保护易感人群。传统的病毒分离培养是测定样品感染性的金标准,但对于高致病性的SARS-Co V-2病毒而言,病毒分离不适合在生物安全等级较低的基层实验室广泛推广,需要简便易行的替代实验方案。本文拟对目前文献中报道的各种评估SARSCo V-2病毒样品感染性的方法进行概述,探索可以规避生物安全等级限制的替代方法,促进基层实验室因地制宜地开展样品感染性风险评估,合理配置公共卫生资源,优化疫情防控措施,促进COVID-19的精准防控。

1 病毒分离培养

病毒分离培养是公认的评判样品是否具有感染性的经典方法。按照生物学分类,SARS-Co V-2病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)β 冠状病毒属(Betacoronavirus)。病毒感染细胞的过程需要2种受体参与:血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane Serine Protease 2,TMPRSS2)[8]。已经证明非洲绿猴肾上皮细胞(Vero-CCL81细胞、Vero E6细胞)、人类肺细胞系(Calu3细胞)、人类肠道细胞系(Caco2细胞)以及一些改造过的表达上述受体的细胞系均能够支持SARS-Co V-2 病毒的生长,并被成功应用于评估不同种类样品的感染性[8-9]。样品接种敏感细胞系之后,3～5 d观察到明显细胞病变效应的样品视为培养阳性,随后进一步通过实时荧光RT-PCR、透射电镜、免疫染色等证明培养物中存在的SARS-Co V-2 病毒成分。所有分离培养阳性的样品无疑都具有感染性,具备传播感染其它人或动物的能力。

在疫情暴发初期,由于缺乏SARS-Co V-2病毒感染性持续时间的数据,Bullard等[10]通过病毒分离方法回顾性地评价了RT-PCR 阳性样品的循环阈值(Ct)、病程与感染性的关系。他们将90 份阳性样品接种细胞,26份(28.9%)分离阳性。进一步分析发现仅Ct＜24,发病时间＜8 d的患者样品才能够感染细胞;而来自Ct＞24,发病症状＞8 d患者样品的感染性较低。相关信息对于早期规划公共卫生政策和指导临床、感染控制及职业卫生决策具有较大参考价值。Gniazdowski等[11]对131名分子诊断阳性患者样品的研究,得到类似结论。他们将样品接种细胞,总体可回收病毒样品Ct值均数为18.8。Ct值在10～20的样品病毒生长效率高,其培养阳性率达76.7%,Ct值在20～30分离率下降至24.1%,Ct值在30～40时仅2.9%。除了呼吸道样品,偶尔有其它团队报道在粪便、尿液分离到病毒[12-13]。随着疫情持续蔓延,检测范围逐渐扩大,一些来自外环境的样品如污水、患者接触过的物品等,虽然检测到SARS-Co V-2病毒遗传物质,但很少能够分离到有复制能力和感染性的病毒,显示这类样品的潜在感染性有限[5,9]。

病毒分离培养技术难度不高,但存在以下明显的缺陷,如敏感性较低、实验周期较长(数日到数周)、必须在高等级生物安全实验室(BSL-3 级)开展,因此不适合作为常规方法在基层临床实验室普遍推广,目前主要用于SARS-Co V-2病毒的基础研究和疫苗开发[8-9]。

2 病毒抗原检测

COVID-19疫情暴发之后,最初研发进入市场的是常见的SARS-Co V-2病毒核酸试剂盒,能够确认样品是否含有病毒RNA,但不能评估阳性样品中病毒RNA 是否处于活跃复制状态,即是否具有感染性。随后也有大量检测病毒抗原的试剂盒被开发并投入市场,检测靶标主要是病毒内部的核衣壳蛋白N、病毒外部表面刺突蛋白S 的亚基S1 和S2。通过能够结合病毒N 或S蛋白的特异抗体,捕获并检测完整病毒颗粒、裂解毒粒或感染细胞碎片中的病毒抗原。抗原检测通常采用侧流免疫层析的方法,在15～30 min内完成,因此属于快速检测方法,适合用于即时检测(point-of-care tests,POCT),样品类型以呼吸道标本为主[1,4,9]。被感染者在体内病毒排放高峰时期将病毒传播给他人的风险最高,此时快速抗原检测结果应该为阳性,因此检测病毒抗原也是能够作为评价样品感染性的指标[14]。

SARS-Co V-2病毒抗原检测对于病毒载量高的样品比较敏感,对病毒载量低的样品敏感性不如常见的SARS-Co V-2 病毒核酸检测方法[4,14]。Nordgren等[15]对一批瑞典患者样品进行抗原检测,对Ct值＜25样品的敏感性超过88%;与细胞培养相比,Panbio公司和Orient Gene公司的抗原检测结果敏感性分别为94.1%和97.1%。2种抗原检测试剂对N 蛋白的敏感性均＜50 pg,所有Ct值＞27的样品均无感染性病毒。类似地,Korenkov 等[16]对2 028份样品检测,发现快速抗原检测试剂对Ct＜20、Ct＜25、Ct＜30 3 组样品的敏感性分别为100%、98.25%和88.64%,所有29份培养阳性的样品均能够检测到病毒抗原,显示快速抗原检测适合检出可能传播SARS-Co V-2病毒的高RNA 载量样品。总的说来,病毒抗原快速检测具有成本低、操作简单、快速的优点,适合大规模筛查的需要。其缺点在于抗原检测过程中没有扩增步骤,敏感性明显低于病毒RNA 检测,同时其它冠状病毒的感染可能引起假阳性[4,9,14]。

3 病毒亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA)检测

SARS-Co V-2病毒复制过程中,存在大量负链RNA 中间产物,能够在感染细胞中转录,却不能包装到成熟病毒颗粒中,称为病毒亚基因组,其主要特征是存在共同的5′端非编码区约70 nt的先导序列[9,17]。有研究显示,检测到sgRNA 与发病后5～7 d的高病毒载量相关,大多数病毒传播也发生在这个时间段,因此sgRNA 阳性就表明病毒处于活动复制状态,也可以作为评估样品感染性的替代指标。在SARS-Co V-2病毒感染细胞中,不同基因的sg RNA 表达存在差异,其中N 基因sgRNA 表达丰度最高,其余依次为S基因、ORF7a、ORF3a、ORF8、M、E、ORF6、ORF7b基因[17-18]。

根据sgRNA 的结构特点,有多种途径能够证实样品中sg RNA 的存在,包括Northern 杂交、逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光RT-PCR(RTqPCR)、数字PCR(dPCR)、高通量测序等[17]。这几种方法各有优缺点,其中,Northern杂交的方法能够显示sgRNA 的大小及样品完整性,但操作繁琐、敏感性不够;RT-PCR、RT-qPCR、dPCR 操作简便,相对敏感快速,可同时检测大量样品,但只能检测已知的sgRNA 类型;高通量测序检测sg RNA,能够发现新的sgRNA 种类和稀有突变,但实验流程复杂、周期长,数据分析难度大,检测成本较高。相比之下,利用RT-qPCR 和d PCR 开展SARS-Co V-2病毒sg RNA 检测,也是一种合适的检测样品感染性的替代方法。

来自韩国和西班牙的团队分别证明了sg RNA检测评估样品感染性的可行性。Kim 等[19]采集了20名COVID-19患者189份样品,通过比较细胞分离培养、PCR 检测基因组RNA 和亚基因组RNA,并将样品接种细胞。结果显示sg RNA 检测能够准确预测感染性病毒的排放时间,与细胞培养结果相似,在患者发病早期阳性率最高。同样,Bravo等[20]评估了105 份RT-PCR 阳性呼吸道样品的sg RNA 检测与细胞培养结果,2种方法取得94%的一致性。

4 活力PCR(viability PCR)或核衣壳完整性定量PCR(Capsid integrity quantitative PCR)

COVID-19 大流行疫情出现以后,各种检测SARS-Co V-2病毒RNA 的商品化体外诊断试剂盒得到广泛应用,在全球范围内大规模开展对临床和外环境样品的筛查。RT-qPCR 以其敏感、特异、低成本、半定量等优势成为最常见的SARS-Co V-2病毒RNA 检测方法,但RT-qPCR 不能区分检测到的病毒RNA 是来自有复制能力的病毒,还是残余的无复制能力的RNA 片段,无法确定阳性样品是否具有感染性[1,9]。据文献报道,利用光激活叠氮染料如叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、叠氮溴化乙锭(Ethidium Monoazide,EMA),以及金属化合物如氯化铂(PtCl4)、顺铂(cis-diamineplatinum(II)dichloride,CDDP)等,建立活力PCR或核衣壳完整性定量PCR 的方法,能够区分有复制能力的细菌、病毒与灭活的细菌、病毒[21]。其原理是基于这些化合物能够在核酸提取之前结合样品中灭活细菌、病毒DNA/RNA,使这部分被结合的DNA/RNA 不能在后续反应中被扩增,保证了检测的是来自有复制能力和感染性的细菌、病毒DNA/RNA。这样的预处理选择性地消除了游离核酸和核衣壳缺损的病毒颗粒带来的假阳性信号,因此能够估计样品中病毒的感染性。

由于氯化铂价格低、对可见光不敏感,而光激活叠氮染料不容易渗透到复杂基质中,Cuevas-Ferrando等[22]选择氯化铂,尝试建立检测SARS-Co V-2病毒RNA 的活力RT-qPCR(viability RT-qPCR)体系。经过分析比较,他们认为这种活力RTqPCR足以区分污物表面的无感染性SARS-Co V-2颗粒,有助于更好地评估接触SARS-Co V-2 污染物的感染风险,还能够检测复杂基质(粪便悬液、尿、鼻咽拭子、污水)中潜在的感染性SARS-Co V-2颗粒,因此是一种准确分析感染性病毒材料的备选方案[23]。Hong等[24]则尝试不同去污剂(Triton X100、Triton X-114、Tween 20、Tween 80、SDS)和不同浓度PMA 预处理样品,发现0.005%SDS能够使游离病毒RNA、灭活病毒RNA 与PMA 形成PMA-RNA结合物,不能参与后续PCR 扩增,而复制活跃的病毒颗粒中RNA 不受影响。由此建立的SDS-PMA辅助RT-qPCR 方法能够成功监测SARS-Co V-2在塑料表面上的自然灭活过程,取得与标准噬斑试验相似的结果,表明也能够作为快速、方便评估PCR阳性样品感染性的方法。

5 氧化石墨烯(graphene oxide,GO)预处理

氧化石墨烯具有多个功能基团,包括氧、环氧化物、羰基、羟基,能够吸附核酸、蛋白质、细菌、病毒等多种生物材料。利用这一特性,Yoo等[25]设计了一种包被GO 材料的微型珠子填充的过滤柱对传统核酸提取步骤进行改进。在低pH 值环境中,纳米结构的GO 表面能够吸附样品中有复制能力和感染性的病原体以及无感染性的游离RNA;经过物理、化学方法处理,在高pH 值条件下,吸附的病原体释放出核酸。这部分核酸不能被GO 表面吸附而被洗脱出来,而先前低pH 值环境中吸附的游离核酸仍然停留在GO 表面。因此,只有在裂解步骤从被吸附的活跃复制的病原体中释放出的核酸才能最终进入洗脱液,并有机会参与后续的核酸扩增反应[25]。这个核酸提取方案的有效性首先经过了人工污染的低致病性冠状病毒HCo V229E 病毒样品的测试。随后在现场实验中,从12间COVID-19患者负压病房采样,以湿纸巾采集被污染表面(病床、马桶、病房墙壁、手机)的病原(细菌、SARS-Co V-2)和游离RNA片段)。样品通过上述GO 柱子提取核酸后进行常规扩增,患者病房所有样品均检出细菌(基于16S r DNA),双人病房大多数样品(病床、马桶、手机)都检出SARS-Co V-2,而单人病房仅在手机表面检测到SARS-Co V-2病毒,显示病毒能够通过这些物品表面传播,也证明了纳米结构GO 能够应用于区分、分离物品表面无感染性的游离RNA 片段和有传播风险的活病毒。

6 小结及展望

过去2年全球大流行COVID-19疫情防控的经验表明,大规模开展SARS-Co V-2相关筛查的策略能够有效确定潜在的传染源、减轻持续传播风险。虽然已经在全球范围推广COVID-19 疫苗应急接种,但患者痊愈后再次感染、完成全程疫苗接种后突破感染的案例屡有报告,新的传播能力更强的SARS-Co V-2病毒变异株陆续被检出,不断为COVID-19防控带来新的挑战。按照目前全球监测数据及趋势,COVID-19疫情难以在短时间内完全销声匿迹。为了促进精准防控,合理配置公共卫生资源,减轻疫情相关的社会、经济负担,在大规模开展SARS-Co V-2相关筛查的基础上,有必要进一步分析阳性样品的感染性。

上述几种针对病毒感染性检测方法中,除了病毒分离培养,病毒抗原检测属于即时检测,虽然具有大规模筛查的优势,但敏感性较低,仅适用于发病早期高病毒载量的样品,不适合病程超过10 d、低病毒载量的样品。另外3种方法,亚基因组RNA 检测、活力PCR 和石墨烯预处理,本质都是基于病毒核酸扩增,其敏感性更高,能够适用于观察更长病程的样品,也便于在基层实验室开展。相对来说,sgRNA检测在理论和实践方面都比较成熟,只需要在目前开展的RT-qPCR 和d PCR 基础上进行细微调整,就足以深入分析大规模筛查出来的阳性样品,是最有可能商品化并广泛推广的方法。而活力PCR 和石墨烯预处理的方法,虽然目前相关文献报道较少,但可以按照这样的样品预处理理念,探索更加方便、易行、低成本、高效的预处理材料和方式。

总之,目前细胞培养之外的评估样品感染性的检测方法还处于研发阶段,没有达成广泛的共识,缺乏统一的标准操作方案和结果判定标准。因此,需要通过更多样品的测试,对这类方法评估SARSCo V-2样品感染能力的可靠性进行总结,制定出统一的实验操作方案和判定标准,逐渐在基层实验室推广,科学区分有复制能力和感染性样品和无复制能力无感染性样品,指导当前COVID-19疫情的精准防控。

利益冲突:无

引用本文格式:陈爱平,张拥军.SARS-Co V-2病毒样品感染性评估方法概述[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):523-527.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.080