梁雪荣，路振康，毛晓英，吴庆智，张建

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）是世界第3大豆类，仅次于大豆和豌豆，富含多种营养和功效成分[1]。鹰嘴豆籽粒约含蛋白质15%～30%，且多为优质蛋白，氨基酸组成均衡，极易被人体消化吸收[2]。鹰嘴豆多肽是通过酶解或发酵获得的混合肽，具有多种生物活性，如抗氧化性、免疫调节和降血脂等[3-4]，受到人们的广泛关注。除了营养和健康益处外，鹰嘴豆还含有抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂、血凝素、单宁、植酸和皂甙，这些抗营养因子会影响蛋白质的消化率和营养物质的利用率。发芽是一个低成本的过程，且可以改善鹰嘴豆粉的功能特性和鹰嘴豆分离蛋白的抗氧化特性，并减少其抗营养因子[5]。Milán-Noris等[6]研究了胃肠消化物中的肽和异黄酮对于烹饪或发芽鹰嘴豆的抗炎潜力，结果表明发芽鹰嘴豆蛋白浓缩物在肠道具有抗炎作用的潜力，这可能有助于预防肠道炎症疾病。

沙棘果不仅含有丰富的营养成分，还含有多种活性成分，如黄酮、超氧化物歧化酶、ω-6多不饱和脂肪酸等[7]，具有抗衰老、清除自由基、抗辐射、提高免疫力、抗肿瘤等作用，在医药、保健、食品及化妆品等领域具有非常广阔的发展前景[8-9]。

因此，本研究以发芽鹰嘴豆蛋白为原料，制备发芽鹰嘴豆多肽，调配发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料，对碱性蛋白酶酶解发芽鹰嘴豆蛋白制备发芽鹰嘴豆多肽的工艺和饮料配方进行优化，并对发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的体外抗氧化进行研究，深入探索发芽鹰嘴豆多肽的性质，为鹰嘴豆的深度开发和研究提供一定的借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆（卡布里型，新疆木垒县）：市售；沙棘浓缩汁：新疆慧华沙棘生物科技有限公司。

碱性蛋白酶（酶活 2.0×105U/g）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司；蔗糖（食品级）、柠檬酸（食品级）：上海源叶生物有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氢氧化钠（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平[BS 2000S（d=0.01g）]：北京赛多利斯天平有限公司；高速冷冻离心机（FRESCO-21）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶标仪（K3 Plus）：上海宝予德科学仪器有限公司公司；酸度计（PHS-25）：上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发芽鹰嘴豆蛋白的制备

以发芽鹰嘴豆为原料，30℃低温烘干，经高速粉碎机粉碎，过60目筛，制备发芽鹰嘴豆粉，脱脂后于4℃贮存备用。

发芽鹰嘴豆蛋白的制备参考Feng等[10]的方法并作了修改。将发芽鹰嘴豆粉与水以一定的比例混合，用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至9，搅拌1 h，4 000 r/min离心10min，所得沉淀重复提取2次。将3次上清混合，用0.5mol/LHCl调节pH值至4.3，8000r/min离心10 min，用蒸馏水洗涤沉淀，并将所得蛋白浆pH值调节至7.0，冷冻干燥48 h即为发芽鹰嘴豆蛋白，-20℃贮存备用。

1.3.2 发芽鹰嘴豆多肽的制备

发芽鹰嘴豆多肽的制备参照Yang等[11]的方法并稍作修改。取发芽鹰嘴豆蛋白适量配制固定浓度发芽鹰嘴豆蛋白溶液，调节溶液的pH值，加入碱性蛋白酶，开始酶解。在酶解过程中，不断向体系中加入0.1 mol/L NaOH，来维持体系的pH值恒定，并不断搅拌。酶解之后沸水灭酶10 min，7 000 r/min离心10 min，按照离心后的上清液与TCA水溶液体积比1∶1加入15%（质量比）的TCA水溶液，混匀后静置10 min，3 500 r/min离心10 min，取离心后的上清液1 mL于540 nm处测定其吸光度，其余上清液4℃储存备用。

1.3.3 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺条件

1.3.3.1 单因素试验

单因素的设定参照赵敏[12]的方法并作修改。取发芽鹰嘴豆蛋白适量，初步选定底物浓度为2%，碱性蛋白酶的加酶量为8 000 U/g，酶解pH值为10.0，酶解温度50℃，酶解时间60 min为基础条件，以多肽得率为指标，依次研究底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）；加酶量（2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g）；酶解温度（30、40、50、60、70、80℃）；酶解时间（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 h）的条件下各因素对发芽鹰嘴豆多肽得率的影响，每个试验重复3次。

1.3.3.2 响应面试验优化

在单因素试验结果的基础上，运用Design-Expert 10.0.7设计响应面试验，分析各因素之间的交互作用以及对发芽鹰嘴豆多肽酶解条件的影响。对底物浓度、加酶量、酶解时间进行三因素三水平的试验设计。因素水平设计见表1。

表1 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺响应面优化试验因素水平Table 1 Factors and levels of germinated Cicer arietinum L.polypeptide preparation in response surface optimization test

1.3.4 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的制备

为了保持发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的口感，提升其稳定性，加入了固定配比的食品添加剂，即0.1%的羧甲基纤维素钠和0.08%的黄原胶[13]。

将发芽鹰嘴豆多肽、沙棘浓缩汁、蔗糖、柠檬酸按照一定比例混合于蒸馏水中，进行饮料调配。调配好的饮料于20 MPa下均质5 min，将饮料均匀混合。用纱布过滤，分离不溶性物质。进行灌装，采用巴氏杀菌法灭菌，于65℃保持30 min，冷却到室温后得到成品置于4℃冷藏储存[14]。

1.3.5 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料配制条件优化

1.3.5.1 单因素试验

以可溶性固形物含量9%、发芽鹰嘴豆多肽添加量30%、沙棘浓缩汁添加量2%、柠檬酸添加量0.35%为基础调配条件，以可溶性固形物含量（7%、8%、9%、10%、11%）、发芽鹰嘴豆多肽添加量（15%、20%、25%、30%、35%）、沙棘浓缩汁添加量（1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%）、柠檬酸添加量（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）为变量进行单因素试验，研究各个因素对发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料感官品质的影响。以感官评分为指标进行饮料不同成分的配方含量范围的确定。

1.3.5.2 响应面试验优化

在单因素试验结果的基础上，运用Design-Expert 10.0.7设计响应面试验，分析了各因素之间的交互作用以及对发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料调配的影响。对发芽鹰嘴豆多肽添加量、可溶性固形物含量、沙棘浓缩汁添加量进行三因素三水平的试验设计。因素水平设计见表2。

表2 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料配方响应面优化试验因素水平Table 2 Factors and levels of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage in response surface optimization test

1.3.5.3 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料感官评价标准

由10名具有感官评定经验的食品专业学生组成感官评定小组，每次评定前均用纯净水漱口，依据滋味、色泽、风味、组织状态、口感进行评定[15]。每个样品重复3次，取平均值，满分100分，其中滋味20分，组织状态20分，色泽20分，风味20分，口感20分。感官评定表见表3。

表3 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料感官评价指标及评分标准Table 3 Sensory evaluation indexes and scoring criteria of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage

1.3.6 测定指标及方法

1.3.6.1 标准曲线以及多肽得率的测定

采用双缩脲法进行测定，参照唐开永等[16]的方法并稍作改动。以牛血清蛋白浓度为横坐标x（mg/mL），以吸光值为纵坐标y，绘制多肽标准曲线，得标准回归方程为 y=0.047 5x+0.010 1，决定系数 R2＝0.998 3。

多肽得率的计算参考周丽卿[17]的方法，并稍做修改。取1 mL上清液加入4 mL双缩脲试剂，混匀，静置30 min。用水代替上清液作为空白，在540 nm处测定吸光值。由标准回归方程计算酶解液中的多肽浓度，多肽得率按下式计算。

1.3.6.2 DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率

DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率的测定参照文献[18-19]。

1.3.6.3 理化、微生物指标

总酸含量：采用GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》；pH值：采用pH计测定；可溶性固形物含量：采用手持折光仪法[20]测定；多肽含量：采用双缩脲法[17]测定；致病菌：采用GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》；菌落总数：采用GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠杆菌：采用GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》。

1.3.7 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料稳定性

进行破坏性试验[21]，分别将饮料样品放置在4℃，37℃储藏，参考样本为4℃储藏的饮料，每天观察发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的口感，色泽，香味以及组织状态的变化，并对其进行菌落总数以及pH值测定，以测试发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的稳定性。

2 结果与分析

2.1 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺条件的确定

2.1.1 单因素结果分析

发芽鹰嘴豆多肽制备工艺单因素结果如图1所示。

从图1 A可以看出，随着底物浓度增加，多肽得率出现先增加后下降的趋势。在底物浓度为2%时，其多肽得率最大，说明此时的酶解效果好。因此，选择底物浓度为2%。

图1 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺单因素结果Fig.1 Single factor results of germinated Cicer arietinum L.polypeptide preparation

从图1 B可以看出，在加酶量小于10 000 U/g时，随着加酶量的增加，酶与底物结合的越充分，水解度增大，所以多肽得率也随之增大。在加酶量为10 000 U/g时，多肽得率最高。当加酶量继续增加，导致蛋白的过度水解，所以使多肽得率降低。因此，最佳加酶量为10 000 U/g。

蛋白酶不能在温度过高或过低的情况进行水解，两种状态下都会影响蛋白酶的活性。由图1 C可知，温度过低时，蛋白酶的酶活力未能全部活化，且得不到完整的发挥；当温度过高时，酶结构遭到破坏、失活，从而水解度降低。因此，选择酶解温度为60℃进行酶解。

由图1 D可以看出，随着酶解时间的增加，多肽得率呈先升高再降低的趋势。当水解1.2 h，多肽得率达到最高，之后多肽得率下降，这是因为随着酶解时间的增加，活性肽的数量逐渐增加，但继续延长酶解时间时，底物浓度减少，酶可能作用于活性肽，使多肽水解而失去原有的活性[22]；多肽得率则呈现出逐渐下降的趋势。因此，选择酶解时间为1.2 h。

2.1.2 响应面试验结果

为确定酶解的最佳条件，采用响应面软件设计三因素三水平的响应面优化试验，以多肽得率为响应值，结果见表4。

表4 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺响应面设计及结果Table 4 Response surface design and results of germinated Cicer arietinum L.polypeptide preparation

经多元回归拟合和方差分析，使用Design-Expert 10.0.7对响应面分析得出的回归方程：多肽得率=54.47-1.36A+127B+2.80C+0.014AB-2.60AC-0.82BC-0.94A2+0.97B2-1.51C2。

发芽鹰嘴豆多肽制备工艺响应面优化试验方差分析如表5所示。

表5 发芽鹰嘴豆多肽制备工艺响应面优化试验方差分析Table 5 Analysis of variance of germinated Cicer arietinum L.polypeptide preparation in response surface optimization test

由表5方差分析结果可知，模型显著，且失拟项不显著（P>0.05），说明模型拟合性较好，说明该模型极显著，具有统计学意义。同时，由Design-Expert 10.0.7软件可得模型的相关系数是R2=0.880 3，因此用此模型进行酶解发芽鹰嘴豆蛋白制备发芽鹰嘴豆多肽的分析和预测是合理的。

2.1.3 响应面交互作用分析

酶解时间和底物浓度交互作用如图2所示。

图2 酶解时间和底物浓度交互作用对多肽得率影响Fig.2 Effect of the interaction between enzymatic hydrolysis time and substrate concentration on the yield of polypeptide

响应曲面越陡峭，表明两个因素对多肽得率的影响越大，反之，曲面越平缓表明两个因素对多肽得率的影响越小；等高线图呈现椭圆，表明交互性良好。由图2的响应面图和等高线图可知，底物浓度和酶解时间对多肽得率的影响显著，说明底物浓度和酶解时间交互性良好。

2.1.4 验证试验

通过Design-Expert 10.0.7数据分析软件优化，得到最佳酶解条件参数的理论最佳组合为底物浓度1%，加酶量12 000 U/g，酶解时间1.5 h，此时理论上多肽得率为60.20%。以此条件进行验证试验，得到多肽得率实际值为55.07%，与理论值差异不显著（P>0.05），方法可行。

2.2 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的配方优化

2.2.1 单因素结果分析

发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的配方优化单因素结果如图3所示。

图3 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的配方优化单因素结果Fig.3 Single factor results of formula optimization of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage

由图3 A可以看出，当可溶性固形物含量达到9%时，感官评分最高，口感最好，酸甜适中，不会有过腻的口感，能更好的突出鹰嘴豆与沙棘的清香。当可溶性固形物含量大于9%时，甜味过重，饮用量较多时，口感甜腻；当可溶性固形物含量小于9%时，沙棘汁的酸味较重，不能产生令人愉悦的感觉，所以可溶性固形物含量达到9%为宜。

由图3 B可以看出，随着发芽鹰嘴豆多肽含量的增加，感官评分先上升后下降。当发芽鹰嘴豆多肽添加量为30%时，感官评分最高。此时，饮料既具有鹰嘴豆特有的清香也不会有明显的豆腥味。因此发芽鹰嘴豆多肽添加量为30%时饮料感官评分最好。

由图3 C可以看出，沙棘浓缩汁添加量从1.4%增加到2.0%，感官评分随沙棘浓缩汁添加量的增加而增大，呈现上升趋势，但在沙棘浓缩汁添加量大于2.0%时，感官评分逐渐降低，这是因为过量的沙棘浓缩汁使复合饮料口感变酸，并且具有难以接受的沙棘汁的味道。因此选择沙棘浓缩汁添加量为2.0%。

由图3 D可以看出，柠檬酸添加量由0.20%至0.40%，感官评分随柠檬酸添加量增加先升高后下降。当柠檬酸添加量为0.35%时，感官评分可达到最高，此时饮料酸甜可口。柠檬酸添加量过低会使饮料的风味和口感较平淡，而柠檬酸添加量超过0.35%时会使饮料具有明显的酸味，过酸过涩破坏了发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的口感。因此选择柠檬酸添加量为0.35%。

2.2.2 响应面试验结果

根据单因素试验结果，综合考虑，以可溶性固形物含量（D）、发芽鹰嘴豆多肽添加量（E）、沙棘浓缩汁添加量（H）为自变量，发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料感官评分为响应值，进行三因素水平响应试验，试验设计见表6，方差分析见表7。

表6 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料配方优化响应面试验结果Table 6 Response surface test results of formula optimization of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage

运用Design-Expert 10.0.7软件对表中的试验数据进行多元回归分析，得到的试验因素对感官评价的拟合方程：感官评分=88.80+2.38D-1.00E+2.88H+1.50DE+0.75DH-12.28D2-3.03E2-3.2H2。

由表7可知，该回归模型F=76.82，P<0.000 1，模型显著，失拟项F=1.18，P=0.422 1>0.05，结果为不显著，表明该模型的试验数据可靠，R2=0.990 0接近1，表明此模型拟合较好，试验误差小，可用此模型对多肽得率进行分析和预测。根据F值可知，各个因素对多肽得率的影响大小顺序：沙棘浓缩汁添加量（H）>可溶性固形物含量（D）>发芽鹰嘴豆多肽添加量（E）。

表7 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料配方优化响应面优化试验方差分析Table 7 Analysis of variance of formula optimization of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage in response surface optimization test

2.2.3 各因素相互作用的响应曲面图

发芽鹰嘴豆多肽添加量和可溶性固形物含量交互作用如图4所示。

图4 发芽鹰嘴豆多肽添加量和可溶性固形物含量交互作用对感官评价影响Fig.4 Effect of the interaction between germinated Cicer arietinum L.polypeptide addition and soluble solid content on sensory evaluation

图4中的响应曲面图坡度较陡峭，等高线呈椭圆形较为密集，说明可溶性固形物含量和发芽鹰嘴豆多肽添加量的交互作用对发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的调配工艺的影响较为显著，这与表7中PDE<0.05的结论一致。

2.2.4 验证试验

根据回归模型，发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料调配的最佳组合为可溶性固形物9.1%，多肽添加量为25.7%，沙棘浓缩汁添加量2.2%。发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的感官评分为89.6。实际操作中，调整可溶性固形物含量为9.0%，多肽添加量为25.0%，沙棘浓缩汁添加量为2.0%后进行验证试验，得到发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的感官评分为86。较接近的实际值和理论值，证明方法可行。

2.3 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料品质分析

利用优化后的最佳工艺和配方制作功能性发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料，对产品进行感官、理化、微生物指标和抗氧化性能评价。

2.3.1 感官特性

发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料呈黄色，无分层，无异物，色泽均匀一致，口感细腻，酸甜适中，具有发芽鹰嘴豆多肽和沙棘独特的风味，无肉眼可见杂质。

2.3.2 理化、微生物指标

可溶性固形物含量12.07 mg/mL；多肽含量18.92 mg/mL；pH 值为 3.58。

细菌总数/（CFU/mL）≤26，大肠菌群/（MPN/L）≤2，致病菌未检出。

2.3.3 抗氧化活性

对发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的抗氧化活性测定结果如表8所示。

表8 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料抗氧化活性Table 8 Antioxidant activity of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage

由表8可以得出，发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的DPPH自由基清除能力略低于沙棘浓缩汁，但显著高于发芽鹰嘴豆多肽（P<0.05）；其羟基自由基清除能力略低于发芽鹰嘴豆多肽，但显著高于沙棘浓缩汁的清除能力（P<0.05）。因此，发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料具有较好的DPPH自由基和羟基自由基清除能力。

2.4 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料稳定性试验结果

发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料稳定性试验结果如表9所示。

表9 发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料稳定性试验结果Table 9 Stability test results of germinated Cicer arietinum L.polypeptide/sea-buckthorn compound beverage

以4℃放置的发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料为参照样本，由表9试验结果可知，发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料在37℃的环境下放置4 d后，菌落总数急剧增加，饮料色泽颜色变深，开盖有明显的异味，pH值下降，再存放1 d后因无法食用故停止试验。由此可以推算出发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料在4℃下的保质期为3个月，室温环境下30 d后色泽仍正常[22]。

3 结论

利用碱性蛋白酶水解发芽鹰嘴豆蛋白制备发芽鹰嘴豆多肽的最佳工艺条件是底物浓度1%，加酶量12 000 U/g，酶解时间1.5 h，此时的多肽得率是55.07%。将制备所得发芽鹰嘴豆多肽添加到饮料中，研究发芽鹰嘴豆多肽/沙棘复合饮料的最佳工艺条件为可溶性固形物含量9.0%，多肽添加量25.0%，沙棘浓缩汁添加量2.0%，此饮料对DPPH和羟基自由基的清除率分别为95.31%和94.53%，具有较好的抗氧化活性。