田雪娜，孔唯唯，孙津，程代*

（1.天津科技大学 食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.优能康（天津）医疗科技有限公司，天津 300480）

乳清蛋白（whey protein，WP）是人体所需的优质蛋白质来源之一[1]，主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白等构成[2]。研究发现，乳清蛋白具有增强免疫细胞功能、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、降血压等生理功能[3-4]。此外，乳清蛋白的生物活性较强，氨基酸组成模式与人体十分相似，因而极易被人体吸收利用[1]。酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是酪蛋白酶解产物之一，具有促进钙吸收以及增强免疫力的作用[5]。机体抵抗力调节、新陈代谢、组织修复等维持人体健康的过程，都需要蛋白质的参与，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽作为人体膳食营养补充剂可能是强化机体免疫功能的有效途径。

免疫系统由免疫器官、免疫细胞及免疫因子组成，在识别和排除抗原性异物以及维持机体内环境稳定等方面发挥着重要作用，对预防疾病的发生具有重要的意义[6]。本实验以环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠为模型，探究乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，为乳清蛋白的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白、酪蛋白磷酸肽：优能康（天津）医疗科技有限公司；环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）：美国Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量检测试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性检测试剂盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性检测试剂盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN） 含量检测试剂盒、肌酐（creatinine，CR）含量检测试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；一抗（TLR4、MyD88、NF-κB、β-actin）、二抗（山羊抗兔、山羊抗鼠）：上海碧云天生物技术有限公司；FastKing RT Kit反转录试剂盒、SuperReal Pre－Mix Plus（SYBR Green）实时定量试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；实验所用引物：天津擎科生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YP5101N电子天平：上海恒平仪器有限公司；QUOMTIX65-1CN分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；DM4M显微镜：徕卡显微系统（上海）有限公司；Multiskan FC酶标仪、5810/R离心机：上海赛默飞世尔科技有限公司；CFX connect荧光定量 PCR仪、1658033电泳转印系统：美国Bio-Rad公司；Las4000化学发光仪：美国通用电气公司。

1.3 实验动物

ICR 小鼠 [雄性，（18±2）g，SPF 级，SCXK （京）2019-0010]：斯贝福（北京）实验动物科技有限公司。小鼠饲养环境条件为温度（25±1）℃，湿度（55±5）%，12 h暗/光循环。本研究由天津科技大学实验动物福利伦理委员会批准，遵守所有适用于实验室动物的护理和使用指南。

1.4 方法

1.4.1 动物分组

动物适应性喂养后，称量初始体质量，随机分为4组，分别为空白组（CK）、环磷酰胺模型组（CTX）、乳清蛋白保护组（WP+CTX）、乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽保护组（WP+CPP+CTX）。实验第1天～第3天，除空白组外，其余各组每天腹腔注射0.1 mL 80 mg/kg bw环磷酰胺，建立免疫抑制小鼠模型，空白组每天注射等量生理盐水。第4天起，乳清蛋白保护组每天灌胃0.2 mL 0.85 g/kg bw乳清蛋白（该剂量相当于成人每日每千克体重推荐摄入量的5倍左右）。乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽保护组每天灌胃0.2 mL 0.85 g/kg bw乳清蛋白+0.10 g/kg bw酪蛋白磷酸肽，空白组和模型组每天灌胃等体积生理盐水，连续灌胃14 d后，禁食24 h，麻醉后处以安乐死。眼眶取血，1 500 r/min离心10 min分离血清。解剖，取脾脏、小肠，用于后续指标测定。

1.4.2 检测指标

1.4.2.1 小鼠体质量变化率

从环磷酰胺造模第1天起，每隔1 d记录小鼠体质量，将小鼠前一次体质量记为W1，后一次体质量记为W2，根据下列公式计算小鼠体质量变化率。

小鼠体质量变化率/%=（W2-W1）/W1×100

1.4.2.2 小鼠脾脏指数的测定

分离小鼠脾脏后，置于预冷的生理盐水中清洗，滤纸擦去表面水分后称量小鼠脾脏质量。根据公式：脾脏指数/（mg/g）=脾脏质量/体质量，计算得到小鼠脾脏指数。

1.4.2.3 组织病理学观察

将脾脏和小肠组织在10%甲醛中固定，后经流水冲洗、脱水、浸蜡、包埋等步骤制作石蜡切片，利用苏木精-伊红染色进行组织病理学观察。

1.4.2.4 血清生化指标的检测

分别按照说明书的方法，使用AST活性检测试剂盒、ALT活性检测试剂盒、BUN含量检测试剂盒以及CR含量检测试剂盒对小鼠血清中AST活性、ALT活性、BUN含量和CR含量进行检测。

1.4.2.5 小鼠抗氧化系统指标测定

使用GSH含量检测试剂盒和SOD活性检测试剂盒对小鼠脾脏和小肠中的GSH含量和SOD活性进行检测。

1.4.2.6 TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的活化检测

采用蛋白质免疫印迹技术检测TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的活化。样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离，转移到硝化纤维素膜上。用针对目标蛋白的一抗检测，然后用对应的二抗检测抗体-抗原复合物。通过凝胶成像和分析系统收集信号。

1.4.2.7 脾脏中炎症因子的测定

利用Trizol法提取脾脏组织RNA，利用反转录试剂盒进行cDNA合成，再使用实时定量试剂盒进行基因表达分析。β-actin基因作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算各组mRNA水平，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 统计学分析

利用SPSS Statistics 25软件进行统计分析，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）和LSD法进行多组数据比较，数据记录为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠体质量变化的影响

为探究乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠体质量变化的影响，每隔1 d记录小鼠的体质量变化，结果如图1所示。

图1 小鼠体质量变化Fig.1 Changes in body weight of mice

由图1可知，与空白组相比，模型组小鼠体质量变化率下降明显，表明其生长速度缓慢。在实验的第12天～第16天，WP+CPP+CTX组小鼠体质量较WP+CTX组增加明显，说明乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽可以有效地缓解免疫抑制所致的小鼠体质量降低的情况。

2.2 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠脾脏指数的影响

脾脏是机体重要的免疫器官，脾脏指数在一定程度上可以反映机体免疫功能情况，结果见图2。

图2 小鼠脾脏指数Fig.2 Spleen index of mice

由图2可知，与空白组相比，模型组小鼠脾脏指数显著（P<0.05）降低，表明机体免疫功能失调。经过乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽的保护后，小鼠脾脏指数恢复，与空白组相比没有显著性差异（P>0.05）。

2.3 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠脾脏和小肠组织病理的影响

图3为脾脏组织病理学染色结果。

图3 小鼠脾脏组织病理图（HE染色，100×）Fig.3 Histopathology of mice spleen（HE staining，100×）

由图3可知，空白组小鼠脾脏组织结构清晰，无病变。模型组小鼠脾脏组织结构重度异常，视野内脾小结结构散乱，红白髓分界不清晰，淋巴细胞胞核圆润，局部排列较疏松，红髓内多核巨噬细胞大量增生。经过乳清蛋白保护后，小鼠脾脏组织细胞间质充血情况减轻，但仍存在部分组织充血现象。经过乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽保护后，小鼠脾脏组织状态病理损伤明显发生逆转。

图4为小肠组织病理学染色结果。

图4 小鼠小肠组织病理图（HE染色，100×）Fig.4 Histopathology of mice small intestine（HE staining，100×）

由图4可知，空白组小鼠小肠组织上皮细胞排列整齐，无病变。模型组小鼠小肠组织结构异常，固有层可见少量炎症细胞浸润；隐窝上皮胞浆淡染，显示气球样变，伴有明显的水肿；黏膜下层水肿，致使黏膜层和肌层出现较大间隙。经过乳清蛋白保护后，小鼠小肠组织结构排列稍有松散，但整体病变程度明显减轻。经过乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽的保护后，小鼠小肠组织结构较为完整，排列较为整齐。

2.4 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠肝肾功能的影响

AST和ALT的释放是衡量肝脏功能的重要指标。为了检测乳清蛋白对免疫抑制小鼠肝脏功能的影响，测定了小鼠血清中AST和ALT活性，结果如图5所示。

图5 小鼠血清AST和ALT活性Fig.5 Serum activities of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in mice

由图5可知，模型组小鼠的血清AST活性和ALT活性较空白组分别显著（P<0.05）升高了120.4%和334.5%。与模型组相比，WP+CTX组和WP+CPP+CTX组血清AST活性分别显著（P<0.05）下降了36.4%和47.5%；血清ALT活性分别显著（P<0.05）下降了38.3%和62.7%。结果表明，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对免疫抑制小鼠的肝功能有良好的保护效果。

BUN和CR的升高意味着肾功能的损害，一旦肾功能出现损伤，二者将无法经过肾小球滤过而被直接释放到血液中。小鼠血清中BUN和CR含量如图6所示。

图6 小鼠血清BUN和CR含量Fig.6 Serum levels of blood urea nitrogen and creatinine in mice

由图6可知，模型组小鼠血清BUN和CR含量较空白组显著（P<0.05）升高62.6%和132.8%，表明小鼠肾功能受损。与模型组相比，WP+CTX组和WP+CPP+CTX组小鼠血清BUN含量分别显著（P<0.05）下降了24.3%和30.6%；血清CR含量分别显著（P<0.05）下降了33.1%和51.3%。结果表明，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对免疫抑制小鼠肾功能有良好的保护效果。

2.5 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠抗氧化系统的影响

小鼠脾脏和小肠中GSH含量如图7所示。

图7 小鼠脾脏和小肠中GSH含量Fig.7 Content of glutathione in spleen and small intestine of mice

由图7可知，模型组小鼠脾脏中GSH的含量相比于空白组显著下降了60.9%。与模型组相比，WP+CTX组和WP+CPP+CTX组小鼠脾脏GSH含量分别显著（P<0.05）升高了111.2%和143.6%。与模型组相比，WP+CTX组和WP+CPP+CTX组小鼠小肠GSH含量分别显著（P<0.05）升高了60.0%和119.3%。

小鼠脾脏和小肠中SOD活性如图8所示。

由图8可知，与空白组相比，环磷酰胺处理显著降低了小鼠脾脏和小肠组织中的SOD活性。与模型组相比，WP+CTX组和WP+CPP+CTX组小鼠脾脏中SOD活性依次升高17.8%和28.0%；小肠中SOD活性依次升高22.2%和29.8%。结果表明，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对免疫抑制小鼠的抗氧化系统的影响显著优于乳清蛋白单独保护组。

图8 小鼠脾脏和小肠中SOD活性Fig.8 Activity of superoxide dismutase in spleen and small intestine of mice

2.6 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠脾脏中炎症信号通路活化的影响

TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路在免疫应答过程中发挥关键作用，小鼠TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路表达情况如图9所示。

图9 小鼠脾脏中TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路表达Fig.9 Expression of TLR4/MyD88/NF-κB inflammatory signaling pathway in mice spleen

由图9可知，与空白组相比，模型组小鼠脾脏中TLR4、MyD88、NF-κB 的表达显著（P<0.05）升高，分别为空白组小鼠的1.9倍、2.3倍、2.1倍。经过乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽保护后，炎症蛋白TLR4、MyD88、NF-κB的表达均出现不同程度的下降，下降程度分别为46.6%，55.6%，46.2%，表明乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的激活有良好的作用。

2.7 乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠脾脏中炎症因子表达的影响

一旦TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路被激活，则会诱导靶基因转录产生炎症因子，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对小鼠脾脏中炎症因子表达的影响结果如图10所示。

图10 小鼠脾脏中炎症因子表达水平Fig.10 Expression levels of inflammatory cytokines in mice spleen

由图10可知，模型组小鼠脾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平较空白组显著（P<0.05）升高，分别是空白组的5.5倍、4.5倍、10.6倍。经过乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽的保护后，IL-1β的mRNA水平较模型组显著（P<0.05）下降69.5%，IL-6的mRNA水平较模型组显著（P<0.05）下降73.2%，TNF-α的mRNA水平较模型组显著（P<0.05）下降81.5%。相比于乳清蛋白单独保护，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽对炎症因子的抑制程度更高。

3 讨论与结论

免疫系统在监视、防御和调节机体功能上发挥着重要的作用[7]。脾脏作为机体最大的免疫器官，参与细胞免疫和体液免疫[8]；小肠也是人体重要的免疫器官之一[9]。大多数免疫调节剂存在价格昂贵和具有副作用的缺点[10]。近年来，研究者发现乳清蛋白在调节机体免疫活性方面发挥了关键作用[11-14]。

良好的抗氧化能力对于机体防止氧化损伤和维持免疫稳态至关重要[15]。研究发现，抗氧化活性较高的膳食营养补充剂可以改善免疫功能，并能维持巨噬细胞在氧化应激状态下对细菌的吞噬作用[16]。本研究发现，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽能够增强免疫抑制小鼠脾脏和小肠中GSH和SOD的水平。GSH和SOD能帮助机体保持正常的免疫系统功能，具有清除过量的自由基、减弱脂质过氧化程度的作用[17]。含硫氨基酸和支链氨基酸是合成GSH必需的谷氨酸盐的前体物质之一，能够更好地维持人体的抗氧化能力和水平[18]。乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽通过保护机体免受氧化应激，有效地改善了机体的免疫反应功能，这一调节机制可能与乳清蛋白中含有的含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）和支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）有关。

TLR4是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，能够识别病原体分子，从而影响免疫应答[19]。TLR4表达水平升高激活下游蛋白MyD88和NF-κB信号的级联反应，从而诱导下游靶基因炎症因子的转录[20]。细胞因子、炎症介质等细胞产物参与免疫细胞的各种功能，并在维持机体内环境稳定中发挥关键作用[21]。乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽通过抑制脾脏TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的活化以及炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的产生来实现对免疫抑制小鼠的有益调控，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽的抗炎活性与免疫调节活性之间可能存在潜在关系。

乳清蛋白的应用虽已十分广泛，但是乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽这种蛋白复配应用较少。本文通过增强小鼠免疫功能的研究，为这种新型复配蛋白粉的生物活性功能和应用提供一定的实验依据。相比于单一的乳清蛋白，乳清蛋白联合酪蛋白磷酸肽具有更优的调节机体免疫活性的特点。本研究为乳清蛋白和酪蛋白磷酸肽在食品和医药领域的开发利用提供参考。