黎小军,蔡礼年,郑建永

(1.新余学院基础医学教研室,江西 新余 338004;2.浙江大学化学工程与生物工程学院,浙江 杭州 310027;3.浙江工业大学生物工程学院,浙江 杭州 310032)

0 引言

热稳定酶因其良好的热稳定性和溶剂稳定性而具有很好的生物技术和工业应用潜力[1-3],备受学术界和工业界的关注.嗜热菌是热稳定酶的重要来源[1],不断有新的热稳定酶基因从嗜热菌中被克隆表达.杜邦嗜热菌(Thermomycesdupontii)是近年来被研究较多的一种嗜热真菌，过去其命名比较混乱，曾用名有Talaromycesthermophilus、Thermomycesthermophilus和Talaromycesdupontii等，现被统一命名为Thermomycesdupontii[4-5].

在笔者的前期研究[6]中，通过基因挖掘的策略结合RACE技术，从T.dupontiiATCC 16461菌株中克隆到脂肪酶TDL2，在大肠杆菌和毕赤酵母中异源表达后发现其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)表现出优良的立体选择性，生成普瑞巴林手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸.笔者前期研究还发现:TDL2在大肠杆菌中异源表达活力非常低，其主要原因是大部分酶蛋白形成了包涵体.黑曲霉被FDA划分为“通常是安全的”微生物;作为一种常见的丝状真菌，黑曲霉具有极强的蛋白分泌能力和较为完善的蛋白修饰能力，加上其培养成本低，已被广泛用于食品和工业酶制剂的生产中[7].与异源表达常用的大肠杆菌表达系统相比，虽然黑曲霉表达系统转化难度更大，但它能有效地解决外源蛋白在大肠杆菌中形成包涵体的问题.

本文拟将杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2在黑曲霉系统中异源表达，并考察TDL2自带信号肽和pCAMBIA0380质粒信号肽对脂肪酶TDL2表达的影响，为其应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 以A.nigerCICC 2213作为黑曲霉表达宿主菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，E.coliDH5α用于质粒的构建，携带一个辅助 Ti 质粒的根瘤农杆菌AgrobacteriumtumefaciensAGL-1用于介导黑曲霉转化；黑曲霉表达实验所用质粒为pCAMBIA0380[8],含有黑曲霉的β-葡萄糖苷酶bgl2的信号肽；携带脂肪酶TDL2完整ORF序列(GenBank no. MN782511.1,876 bp)的质粒pGEM-T-TDL2为笔者前期研究[6]构建,用于TDL2基因的克隆.

1.1.2 试剂 ClonExpress®II One Step Cloning Kit购自Vazyme,KOD-Plus-Neo DNA聚合酶购自TOYOBO,DpnI购自TaKaRa;卡那霉素、利福霉素和潮霉素B为Sigma公司产品;引物由常州基宇生物科技有限公司合成.

1.1.3 培养基 LB培养基用于E.coliDH5α和A.tumefaciensAGL-1的培养与筛选;PDA培养基用于黑曲霉的培养;AM培养基和MM培养基用于黑曲霉的转化和筛选实验.

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建 1)利用载体bgl2信号肽的重组质粒构建.以pGEM-T-TDL2为模板，利用引物L3P-S(tggctccctccgtgggtgccGAAGTCTCGCAGGA-TCTGCTCG)(在引物中的小写部分为设计用于无缝克隆的序列,下同)和L3-N(caggctttcgccacggagctTTAATCACACTCTGCAATGGCTCC)进行PCR扩增，获得不含信号肽的TDL2编码序列；同时以pCAMBIA0380为模板，利用引物p-S(AGCTCCGTGGCGA-AAGCCTG)和pP-N(GGCACCCACGGAGGGAGCC)进行扩增包含bgl2信号肽的质粒序列，扩增完成后立即加入1 μLDpnI,在37 ℃下处理1 h,去除质粒模板.PCR体系均为50.0 μL，包含质粒模板0.5 μL、正反引物(5 mmol·L-1)各1.0μL、KOD-Plus-Neo DNA聚合酶1.0 μL.PCR程序:94 ℃ 3min，98 ℃ 10 s，68 ℃ 1 min(在扩增pCAMBIA0380质粒时延伸时间改为6 min),30个循环,68 ℃ 10 min,16 ℃ 5 min.1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因扩增产物和DpnI处理的质粒载体扩增产物.回收的质粒DNA片段和基因片段利用ClonExpress®II One Step Cloning Kit进行拼接，使用方法参照试剂盒说明.拼接液热击法转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布含Kan的LB平板，于37 ℃下培养过夜.挑取Kan平板上的菌落,利用引物YZ-S/YZ-A进行菌落PCR验证，其中正向验证引物YZ-S(TCGACCTGCTGAGGTCCCTCAGTCC)设计在质粒信号肽的上游中，反向验证引物YZ-A(TGAAGGAATGTCCGGGATATTCGGC)设计在目的基因的3′端处.阳性克隆保存并进行测序验证，构建黑曲霉表达质粒pCAMBIA-TDL2-1,用于后续试验.

2)利用TDL2自身信号肽的重组质粒(pCAMBIA-TDL2-2)构建.方法和过程与1)利用载体信号肽的重组质粒构建完全相同，所不同的是在扩增包含信号肽的TDL2编码序列时引物为L3-S(ccgcttgagcagacatcacaATGAGAGGTTTTCTCGTGCTGTTC)和L3-N,在扩增不包含bgl2信号肽的质粒序列时引物为p-S和p-N(TGTGATGTCTGCTCAAGCGGGG).

1.2.2 黑曲霉工程菌的构建 1.2.1节构建并测序验证的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2均通过冻融法转化农杆菌AGL-1.具体操作如下:向A.tumefaciensAGL-1感受态细胞中加入重组质粒10 μL，冰浴5 min，液氮冷冻5 min，37 ℃热激5 min，冰浴5 min，然后加入1 mL LB 液体培养基,28 ℃复苏4 h，涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素和 50 μg·mL-1利福霉素的LB培养基中在28 ℃下培养3 d.在利用验证引物YZ-S和YZ-A进行菌落PCR验证后，阳性克隆保存并用于黑曲霉转化.

根瘤农杆菌介导转化黑曲霉的步骤参照Cai Linian等[8]改良的方法进行，分别将pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2导入宿主细胞A.nigerCICC 2213中.将活化的A.tumefaciensAGL-1和A.nigerCICC 2213孢子悬液混合，并涂布于铺玻璃纸的AM琼脂上，于22 ℃条件下共培养48 h.取出玻璃纸，转移至含有100 μg·mL-1潮霉素B的MM平板上筛选.将筛选出的转化子接种到含有 100 μg·mL-1潮霉素B的PDA 平板上，然后传代至第3代，观察其生长情况，并提取基因组进行PCR验证，验证方法与根瘤农杆菌转化子的验证方法相同.

1.2.3 工程菌的表达 将构建的2个黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2分别接种到含有100 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上，在30 ℃下培养5 d，用无菌水制成孢子浓度为107个·mL-1的孢子悬浮液.按1%的接种量接种发酵摇瓶(在500 mL摇瓶中装有100 mL发酵培养基),在30 ℃下培养6 d.发酵液取样，用于SDS-PAGE分析和活力测定.在发酵结束后，发酵液经纱布过滤并离心，获得粗酶液.

1.2.4 酶活的测定 以对硝基苯月桂酸酯(p-NPL)为底物，通过在405 nm处吸收值的变化快速测定脂肪酶活力，测定方法和酶活定义参照文献[9-10].

2 结果与分析

2.1 杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2黑曲霉工程菌的构建

根据笔者前期研究获得的TDL2序列(GenBank MN782511.1)设计引物,以保存的质粒pGEM-T-TDL2为模板，PCR扩增获得不含信号肽的TDL2编码序列(TDL2-1,810 bp)和含信号肽的TDL2编码序列(TDL2-2,876 bp),两端各含有20 bp用于拼接的序列;同时以pCAMBIA为模板,PCR扩增含bgl2信号肽序列的质粒线性片段(pCAMBIA-1)和不含bgl2信号肽序列的质粒线性片段(pCAMBIA-2).利用ClonExpress®II One Step Cloning Kit,采用无缝克隆技术,将TDL2-1与pCAMBIA-1、TDL2-2与pCAMBIA-2分别拼接,经筛选和测序验证,分别构建利用pCAMBIA质粒bgl2信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和利用脂肪酶TDL2信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-2.质粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2的图谱及构建过程如图1所示.

图1 重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2的构建

通过冻融法分别将重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和pCAMBIA-TDL2-2转化A.tumefaciensAGL-1,验证后利用根瘤农杆菌介导转化A.nigerCICC 2213,经筛选和验证,成功构建黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2.传代培养发现:黑曲霉转化子均能在含有100 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上再次生长，且前后生长形态基本一致(见图2).

注:1-1、1-2和1-3分别为A. niger/pCAMBIA-TDL2-1传代至第1、2、3代的结果,2-1、2-2和2-3分别为A. niger/pCAMBIA-TDL2-2传代至第1、2、3代的结果.

2.2 异源表达分析

将构建的组成型黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2分别于30 ℃下培养6 d,取发酵液进行SDS-PAGE分析(见图3).工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2在分子量为40 kD附近有明显的蛋白表达条带，其大小比预测的分子量略大，这可能原因是与酶蛋白糖基化有关.作为对照的宿主菌A.niger没有该条带,这说明TDL2在A.nigerCICC 2213中被成功表达.从图3还可以看出:泳道3在分子量为40 kD处的条带比泳道1和泳道2的更明显，这说明利用脂肪酶TDL2自身信号肽的A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的表达量比利用bgl2信号肽的A.niger/pCAMBIA-TDL2-1的表达量更大.

注:M为蛋白分子量标准,1和2均为A. niger/pCAMBIA-TDL2-1,3为A. niger/pCAMBIA-TDL2-2,4为空白宿主菌A. niger CICC 2213.

2.3 不同信号肽对表达的影响

以pNPL为底物,测定了在发酵过程中的脂肪酶酶活,在发酵过程中工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的酶活如图4所示.工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-2的发酵曲线相似，前48 h发酵单位均比较低，在发酵120 h后发酵单位达到最大值，分别为18.5 U·mL-1和38.3 U·mL-1,该结果均高于笔者前期研究中脂肪酶TDL2在大肠杆菌中异源表达、低于毕赤酵母异源表达的发酵单位[6].另外,A.niger/pCAMBIA-TDL2-2是A.niger/pCAMBIA-TDL2-1发酵单位的2.07倍，相差较大，此结果与SDS-PAGE分析的目的蛋白表达结果基本吻合，这说明:在构建的2个工程菌中，利用脂肪酶TDL2自身信号肽比利用pCAMBIA 质粒中bgl2信号肽更有利于脂肪酶TDL2的表达，这导致其表达量更大、发酵单位更高.该结果也同时说明来源于T.dupontii的脂肪酶TDL2的信号肽序列能被黑曲霉表达系统识别，这可能原因是与杜邦嗜热菌和黑曲霉同属丝状真菌有关.

图4 工程菌发酵曲线

3 结论

本文通过PCR技术和无缝克隆技术，将来源于杜邦嗜热菌的脂肪酶TDL2的编码序列与质粒pCAMBIA0380线性片段拼接，分别构建利用β-葡萄糖苷酶bgl2信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-1和利用TDL2自带信号肽的重组质粒pCAMBIA-TDL2-2,用根瘤农杆菌介导转化宿主细胞A.nigerCICC 2213,成功构建组成型黑曲霉工程菌A.niger/pCAMBIA-TDL2-1和A.niger/pCAMBIA-TDL2-2,在发酵120 h后其发酵单位分别达到18.5 U·mL-1和38.3 U·mL-1,实现了脂肪酶TDL2在黑曲霉中的异源表达.SDS-PAGE分析和发酵曲线结果表明:脂肪酶TDL2自身信号肽序列能被黑曲霉识别，且利用脂肪酶TDL2自身信号肽比利用bgl2信号肽更有利于脂肪酶TDL2在黑曲霉中的表达，其表达量更大、发酵单位更高.研究结果为杜邦嗜热菌脂肪酶TDL2的应用奠定基础，同时也为其他酶的黑曲霉表达提供参考.