郑荣泉 尹浩

缺血性脑卒中是脑血管病中的急危症,具有较高的致残率和死亡率。大约80%的脑卒中是由于栓子或血栓阻塞血管导致部分大脑循环突然中断［1］。目前针对缺血性脑卒中的治疗在于早期实现再灌注以挽救缺血半暗带中受损的神经元［2］。然而,再灌注会导致炎症反应引起的继发性组织损伤,称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)［3］。目 前临床上控制炎症以治疗CIRI 的策略并不令人满意,而NP 能够克服大脑中的生物障碍,为缺血性脑卒中治疗提供了一个新的方向。

1 脑卒中

CIRI 是一个多细胞参与的复杂的级联反应,病理生理过程复杂,包括自由基氧产生［如O2-和过氧化氢(H2O2)］、能量代谢障碍、细胞Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性、线粒体损伤、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)大量合成、氧化应激、多巴胺和神经细胞凋亡有关,此外,炎症细胞因子上调,内皮细胞被激活,免疫细胞从循环系统迁移到脑组织［3-5］。炎症反应在CIRI 中起关键作用［6］。小胶质细胞(microglia,MG)被认为是炎症反应的关键细胞［7］。有文献报道MG 行为与疾病严重性相关［8］。

2 MG

2.1 MG 概述 目前认为MG 来源于造血系统的原始造血干细胞产生的巨噬细胞［9］。MG 是中枢神经系统(central nervous system,CNS)内固有的免疫细胞,约占脑实质的10%［10］,具有免疫和炎症的多重功能,也具有吞噬作用,能够清除病原体或受损的神经元。作为CNS 的第一道免疫防线［11］,在脑内稳态和脑疾病的神经保护中发挥重要作用［12］,任何原因引起脑内环境紊乱都可激活MG。MG 过度激活导致炎症反应是许多神经系统疾病发生的关键［13］。

2.2 MG 与炎症反应 MG 活化指其形态学的变化,在正常脑组织中,由于受神经元抑制作用,MG 呈分枝状,不断巡逻CNS 实质以维持CNS 的稳态,此时的MG 为静息状态。当损伤或疾病发生时,失去了抑制作用,MG 迅速被激活,激活后呈阿米巴样,即活化状态,活化后的MG 作为CNS 中的定植炎症细胞参与炎症反应和免疫应答［14］。

中枢神经炎症反应是由MG 激活及细胞因子和炎症介质释放所引起的。活化的MG 被认为是CNS 中多种神经毒性因子的来源,如活性氧(ROS)。MG 的激活是一个复杂的过程,会受到许多物质和周围微环境的影响。MG 一旦受到干扰,就会被激活并将邻近的MG和(或)外周巨噬细胞募集到损伤部位［15］。在不同的病理阶段,MG 与其他细胞类型(如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞)动态相互作用并受其影响。因此,MG 的反应是可变的,并且会随着中风后的时间而变化［11］。

MG 可以在表型上极化为两种主要表型：“经典激活”M1 和“替代激活”M2。M1 型MG 是促炎反应,其特征是表达CD86,CD16 和CD32 等；产生各种炎症介质,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-β(IFN-β)和白细胞介素-23(IL-23)等各种趋化因子和炎症因子,来清除病原体和受损细胞,但过多的释放炎症介质,如NO、氧自由基等也会引起促炎和和细胞毒性,损伤正常神经细胞,加重神经损伤。相比之下,M2 型被视为“修复细胞”,M2 型MG 表达精氨酸酶-1 (Arg-1),CD206 和类胰岛素一号增长因子(IGF-1)等。分泌抗炎介质,如促进组织修复的白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-10(IL-10)以及一些神经营养因子如神经生长因子(nerve growth factor,NGF)等营养因子促进损伤神经的修复与再生,从而抑制炎症反应并促进组织再生。此外,与M2 型MG 相比,M1 型MG虽然能够促进神经突触再生,但却有神经毒性作用,Ml型更倾向于诱导神经元死亡。M1/M2 细胞的比例失调有助于CIRI 后脑炎症反应发生［16,17］。

已有研究表明,在CIRI 后第0～3 天,活化的MG被募集到梗死周围区域并动态极化短暂的抗炎和保护性M2 表型［16］。M2 型MG 早在缺血后1 h 就被迅速激活,在受损组织中释放的腺苷三磷酸(ATP)分子。然而,MG 易受缺氧环境影响,如果缺血持续时间超过MG 耐受阈值,MG 就会在缺血核心死亡。在缺氧条件下,MG 释放促炎细胞因子,如白细胞介素-8(IL-8)和TNF-α,并最终经历缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) 依赖性自噬细胞死亡［10］。CIRI 后第3～14 天,M2 表型被逆转为持续的促炎和有害M1 表型,促炎性M1 表型在第3 天迅速增加,并在CIRI 的第1 周内占据梗死周围区域［16］。M2 型主要出现在早期,损伤后3～5 d 开始逐渐向M1 型转变,这种转变将会持续到第14 天。MG的这种动态变化过程对脑损伤的研究与治疗有着重要的意义。因此,了解MG 在CIRI 过程中的作用及机制,可能为CIRI 治疗提供新的策略。

3 CIRI 与NP

目前缺血性脑卒中的治疗局限,虽然改善循环、营养神经等治疗方法有效,但对于再灌注所引起的急性脑损伤效果不理想［18］。近些年来,随着纳米技术的快速发展,纳米粒子(nanoparticles,NP)可以有效逆转缺血性脑卒中再灌注引起的损伤。大多数机制是NP具有延长血液循环时间、降低清除率、提高血脑屏障(BBB)渗透能力和增强脑积聚［19］。减轻神经炎症已成为改善预后的有效辅助疗法［20］。减轻炎症的主要方法有两种：减少从血液渗入损伤部位的炎症细胞和抑制病灶部位的炎症细胞活化和增殖［21］。

BBB 和炎性内皮细胞对于中风治疗中的药物递送和炎性细胞浸润都至关重要［22］。特别BBB 是阻止治疗药物进入CNS 的主要障碍［6］。缺血性脑卒中会在短时间内(几分钟到几小时)启动BBB 开放,然后在较长时间内(几小时到几天)再次重新开放。缺血区域的再灌注(血液供应的恢复)对于减少脑损伤至关重要,同时也可能导致再灌注损伤,导致BBB 重新开放［23］。

3.1 NP 作为药物载体与药物纳米化 NP 因其体积小、无毒、生物降解性、非免疫原性、在生物系统中持续释放药物的能力和在炎症区域积聚的倾向而被认为是最有效的药物传递载体［24］。许多药物之所以无效或疗效不佳,是因为它们没有靶向输送到患病区域。为了解决这一问题,纳米技术靶向给药成为一种有效的治疗方法。纳米技术可以根据不同的目的修饰或模仿生物活性,允许药物高效和按需释放到靶向区域,最大限度地发挥药物的治疗效果,同时最大限度地减少副作用［25］。最近,一些研究表明,以NP 为载体的复合药物可以改善缺血性脑卒中的治疗。不同的NP 配方可以增加CNS 药物的生物利用度。例如：聚乙二醇化NP、聚合物NP、不同类型的脂质NP［8,26］。适当的细胞内转运治疗药物又是另一个难题,但NP 可以利用MG 中现有的内吞途径进行内化。由于MG 在激活状态下吞噬行为的增加,MG 是药物递送的有效细胞靶标。量子点 (QD) 和聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物等NP 具有MG 特异性药物递送［8］。药物的纳米化可以增加其饱和溶解度,据报道,纳米悬浮液制剂可以提高生物利用度。因此,以纳米晶体的形式制备低溶解度药物或化合物的能力为药物治疗和药物传递提供了一个新的范式［26］。

3.2 NP 抗炎、抗氧化作用及NP 成像 NP 还具有抗炎、抗氧化作用。纳米技术介导的抗氧化治疗已被证明是一种很有前途的治疗氧化损伤引起的疾病的方法,氧化铈、金NP 等均得到证实［19］。目前治疗脑部疾病的一个新兴模式是将治疗和诊断药物共同输送到目标部位,同时帮助监测治疗药物的有效性,但挑战在于确定成像和治疗药物的理想组合,这种组合能够协同作用,并确保它们共同输送到受影响的区域,克服强大的BBB。正是在这种背景下,以纳米技术为基础的干预具有重要意义。利用纳米尺度载体系统,同时将影像和治疗剂通过BBB 送到受影响的部位,对于脑卒中的治疗来说是一个新前景［27］。

4 MG 与NP

4.1 抑制MG 极化和促进M1 转化为M2 控制MG的激活状态和直接抑制促炎因子是预防缺血性中风引起的损伤的潜在干预措施［17］。MG 功能与其表型密切相关,如能抑制MG 激活,特别是M1 型MG,能减轻或抑制炎症反应,减少脑损伤。阿奇霉素(AZ)可以抑制病理性MG 激活以应对缺血性中风损伤。Joseph 等［8］设计了聚苯乙烯-聚乙二醇(PS-PEG)纳米颗粒递送AZ,通过纳米颗粒运载到达中枢抑制MG 的激活来减轻炎症反应。姜黄素具有抗炎和抗氧化作用,姜黄素可以抑制活性氧形成,减少炎症损伤,但姜黄素水溶性差和化学性质不稳定,在很大程度上限制了其生物医学应用。Wang 等［28］研究了包裹姜黄素的纳米颗粒(NPcurcumin) 可以提高姜黄素的稳定性,延长其在体内的循环时间。通过降低BBB 通透性保护BBB 和抑制M1 型MG 激活并减弱了TNF-α 和白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌来减少缺血半暗带中的氧化应激和炎症,从而减少了梗死面积和改善功能恢复。Liu 等［29］研究发现一定浓度金NP(Au-NPs)可提高了抗炎细胞因子的产生,并抑制了CIRI 诱导的星形胶质细胞和M1型MG 的激活,抗凋亡蛋白表达上调,促凋亡分子表达下调,可显著改善神经功能缺损和梗死体积,其神经保护作用主要是由于其抗炎和抗凋亡作用。

促进MG 从M1 极化到M2(抗炎型)可以减弱炎症反应并挽救受损的神经元,这也是近年来研究的热点［2,30］。有文献报道一些小分子药物,如芬戈莫德(FTY),可以促进MG 向M2 型极化［2］。Li 等［2］制备了一种装载芬戈莫德(FTY)的巨噬细胞封装的蜂窝状二氧化锰(MnO2) 纳米球。FTY 通过静电相互作用封装在MnO2纳米颗粒中,通过激活信号转导和转录激活因子3(STAT3) 通路促进MG 的表型转变,从而逆转促炎微环境。Mujagić 等［30］研究氮氧自由基(4-氨基-TEMPOL)偶联纳米粒子(RNPs,抗氧化纳米药物),与 TEMPOL 相比,它们的直径为30 nm,静脉注射后半衰期长60 倍。RNPs 能抑制BBB 破坏并支持MG 极化为M2 型MG,提高ROS 清除能力,从而提高了存活率和神经功能缺损。

4.2 抑制MG 增殖 对于已经存在于大脑中的MG,当务之急是削弱它们在原位的功能和增殖。例如,雷帕霉素(RAP)可以显著减少巨噬细胞和MG 产生的促炎细胞因子和趋化因子［22］。Wang 等［22］报道了一种单核细胞膜包被雷帕霉素纳米粒子(McM/RNPs),McM/RNPs 可以主动靶向并结合炎症内皮细胞,抑制单核细胞与内皮细胞的粘附,从而起到屏障的作用。随后,McM/RNPs 可以穿透内皮到达损伤部位,释放雷帕霉素(RAP)药物抑制MG 的增殖,起到缓解炎症的作用。

4.3 抑制MG 功能 MG 是CNS 中补体成分C3 的重要局部来源,而C3 在CIRI 后的MG 神经毒性中起核心作用。MG 在 CIRI 损伤发生后的几分钟内迅速粘附、迁移并进入半暗带,并诱导大量 C3 在半暗带内沉积。反过来,沉积的C3 会进一步加剧MG 的激活并放大炎症级联反应,导致神经元损伤。此外,C3 被切割成抗微生物肽C3a 和调理素C3b。C3b 在附近神经元表面的沉积导致其与MG 上的补体受体3 (CR3)结合,从而增加神经元的MG 吞噬作用。Wang 等［31］制备了装载C3-siRNA 的纳米碳化硅。该NP 可以有效地将C3-siRNA 从血液中穿过BBB 传递到缺血半暗带,并显著降低MG 和缺血脑组织中C3 的表达,减少了神经元上的C3b 沉积并减少了MG 介导的神经元损伤,阻止神经元凋亡,减少缺血区的体积,显著改善CIRI 损伤后的功能恢复。

4.4 监测活化MG 由于活化MG 分泌促炎和抗炎因子和其他分子介质,导致炎症反应。如果能采用非侵入性方法在体内识别活化MG 就可以更早地检测到神经炎症,并提供一种监测疾病进展和治疗干预的方法。目前,大多数活化MG 成像探针主要设计用于正电子发射断层扫描(PET)和目标易位蛋白,这些蛋白也存在于其他脑细胞上。获得的PET 图像并不特定于MG 驱动的炎症。Tang 等［7］设计了一种潜在的PET/MRI 多模式成像探针-硫酸化葡聚糖包被的氧化铁(SDIO)NP,它选择性地靶向活化MG 表达的清道夫受体A 类(SR-A),SDIO 被MG 迅速吸收,在小鼠模型中静脉注射时显示无毒性。SDIO 显著增强了对比度,而使用非靶向NP 或未使用NP 的动物对比度几乎没有变化。因此,SR-A 定位代表了一种很有前途的策略,可以对大脑中激活的MG 进行成像。进行无创成像的能力将为研究和临床应用提供有价值的信息。

综上所述,缺血性脑卒中的发生难以预料且症状严重。目前临床上治疗方法仅有溶栓使血管再通效果显著,重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶栓治疗是目前主要治疗方法,但仍存在许多问题,包括时间窗窄、半衰期短、rt-PA 诱导再灌注和氧化损伤等。纳米技术的发展为脑再灌注损伤提供新的治疗方法。目前NP 用于抑制MG 活化。抑制MG 活化并不是完全抑制其活性,而是通过抑制M1 型的过度激活,从而抑制炎症因子、细胞毒性因子的释放,达到调节M1/M2平衡的作用,从而使MG 的激活向改善神经炎症的方向发展,达到缓解或治疗疾病的效果。保护神经元不受损坏也是治疗CIRI 的研究热点和方向。现阶段作为治疗脑卒中的NP 仍在研究当中,尚存在诸多问题,包括NP 的毒性、体内代谢过程等。不过,NP 用于治疗脑再灌注损伤是一个很有前景的治疗方法。