朱博文 黄煜 俞冬熠 颜莉莉 张清宇 宋黄贝

(1 青岛大学附属青岛妇女儿童医院妇科中心，山东 青岛 266034； 2 洛阳市第三人民医院妇产科；3 青岛大学附属青岛妇女儿童医院遗传科)

复发性自然流产(RSA)曾定义为：妊娠20周前的连续3次或3次以上孕龄妇女妊娠物的丢失，在育龄妇女中约占1%～3%[1]。目前研究人员及临床医生将RSA重新定义为：与同一性伴侣发生连续2次或2次以上的自然流产[2]，在育龄期妇女中所占的比例约为4.1%[3]。目前已知其病因复杂多样，其中已被多数学者认可的因素包括：染色体异常、生殖道解剖结构异常、免疫功能缺陷、内分泌系统紊乱、感染因素、男方精液异常、血栓形成倾向及环境因素等。在世界范围内，因染色体异常而反复流产的夫妇有2%～8%[4]，流行病学上最常见的原因是胎儿染色体异常，约占RSA病因的50%～60%[5]。研究表明每多一次连续自然流产会增加再次妊娠流产的风险，连续3次自然流产，再次妊娠流产的风险达45%[6-7]。由于目前尚缺乏大样本RSA绒毛组织染色体研究，且现常用的绒毛染色体检测方法存在不足之处，因此，选择一种全面、精确的检测方法对在基因水平上进一步诊断RSA病因来说，显得尤为重要。本研究采用高通量基因测序技术即下一代测序技术(NGS)对RSA患者绒毛组织进行遗传学分析，旨在探讨RSA相关因素与绒毛染色体异常之间可能存在的关系，以及NGS在RSA遗传学诊断中的应用价值，为临床上合理指导下次妊娠提供依据和参考。

1 对象与方法

1.1 对象及分组

1.1.1研究对象 选取2017年7月—2018年2月就诊于青岛市妇女儿童医院的RSA患者29例。纳入标准为:①平时月经规律；②无停经后药物服用史；③无内分泌及免疫系统疾病；④无TORCH感染史；⑤无生殖道解剖结构异常及器质性病变；⑥无有害物质接触史；⑦临床病史、体征、B超及血HCG检测均提示难免流产或胚胎停育；⑧排除人工流产及药物流产。病人平均年龄(32.55±5.34)岁，妊娠时间(73.52±11.92)d。本研究已获本院伦理委员会批准，所有病人及家属均知情同意。

1.1.2分组 ①依据是否原发性RSA分组：Ⅰ组为原发性RSA组，Ⅱ组为继发性RSA组；②依据年龄分组：Ⅰ组为22～34岁，Ⅱ组为35岁及以上；③依据流产次数分组：Ⅰ组为连续2次自然流产，Ⅱ组为2次以上自然流产；④依据孕周分组：Ⅰ组为妊娠周数≤10周，Ⅱ组为妊娠周数>10周。

1.2 样本准备及绒毛染色体检测方法

所有患者术前均签订知情同意书，行清宫术无菌获取绒毛组织，生理盐水清洗血污，于我院遗传科BGISEQ-1000测序仪(基于CG测序平台)上行高通量测序。具体操作如下：提取绒毛组织全基因组DNA，超声打断仪将提取的DNA打断成小片段核酸，构建小片段DNA文库，上机测序并进行遗传信息分析，通过软件转换及计算，得到异常染色体图谱。检测结果参考人类基因组hg19版本和DGV、DECIPHER、OMIM及PubMed等公共数据库已公布的数据而确定的。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件对结果进行统计学分析，染色体检测率用百分比表示，组间比较采用Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胚胎绒毛染色体核型分析

应用NGS 技术29例绒毛组织染色体均检测成功，成功率为100%。检出正常的染色体标本7例(24.1%)，异常的标本22例(75.9%)；异常的22例中染色体数目异常21例(95.5%)，其中三体型17例(77.3%)，单体4例(18.2%)，结构异常1例(4.5%)，三体以16-三体最多见(22.7%)。异常核型见表1。

表1 胚胎绒毛组织染色体核型分析

2.2 RSA与其相关因素分析

29例患者中胚胎染色体异常发生率与其是否原发性RSA、年龄、流产次数及其孕周无关(P>0.05)，但继发、高龄、多次流产史、孕周小等因素可能与RSA的发生相关，此类患者其胚胎染色体异常发生率有较高趋势。染色体核型分析见表2。

表2 不同组间胚胎染色体核型分析[例(χ/%)]

3 讨 论

RSA是孕龄期妇女妊娠期常见的并发症之一。流行病学调查结果显示，连续2次流产史的育龄妇女再次成功妊娠的概率约为75%，连续3次约为70%，4次以上的成功率仅为50%[8]。染色体异常是RSA最常见的原因，包括流产病人夫妻双方的染色体异常、胚胎来源染色体异常及其他因素如遗传印记异常、单亲二倍体(UPD)、偏斜X-染色体失活等，而胚胎染色体异常是主要原因。研究指出，染色体异常率随着流产次数增多而增高[9]。本研究的29例RSA绒毛组织中，流产2次者18例(62.1%，18/29)，染色体异常率为66.7%(12/18)；流产2次以上者11例(37.9%，11/29),染色体异常率为90.9%(10/11)，与该报道相符。但有研究却表明，正常发育胚胎染色体异常率为3.33%，发生1次自然流产、2次自然流产、3次及以上流产的染色体异常率分别为44.44%、57.50%、34.88%，认为随着流产次数的增加，染色体核型异常率反而降低，与本研究不符[10]。这可能与检测手段的灵敏性、精确性以及样本量大小有关。同时，研究发现不同流产次数RSA患者间染色体异常率无统计学意义，与相关研究结果一致[11-12]，表明多次自然流产史可能并不是影响胎儿染色体异常的主要因素，考虑更多其他因素如解剖、免疫、内分泌、感染等因素参与了RSA的发生。

本研究中入组的29例RSA患者绒毛染色体异常率为76%,高于之前研究报道的29%～50%的结果[13]。其中，以染色体数目异常为主，最常见的是染色体三体。三体性通常来源于母体减数分裂过程中的不分离，与产妇的年龄密切相关[14]。许多报道表明，高龄产妇的年龄是一个与染色体非整倍性有关的重要因素，基于高龄产妇染色体异常率大于年轻产妇，分析认为高龄是单次和RSA的独立危险因素[15]。KROON等[16]的研究表明，35岁以上妇女的胚胎非整倍体发生率明显高于35岁以下妇女。本研究结果也显示，高龄产妇(≥35岁)染色体非整倍体发生率高于低龄产妇，即随着产妇年龄的增长，胚胎染色体非整倍体率亦升高，与以往报道结果一致[17]。研究表明，在异常非整倍体中，16三体占比最高，称为“流产染色体”，其后是X单体和22单体，且在高龄产妇(≥35岁)和年轻产妇(<35岁)中绒毛染色体异常发生率无统计学意义，与本研究结果是一致的[18]。而STEPHENSON等[19]报道自然流产最常见的三体征是15三体，其次是16、22三体，与本研究结果不一致，这些差异可能是由于样本中产妇的年龄和孕周较小(小于6周)造成的。为了确定绒毛染色体非整倍体是否是RSA的主要原因，有研究比较了RSA和散发性流产绒毛染色体非整倍体率的情况，发现两组之间无显著差异，表明可能有其他更多的因素造成RSA[18]。

以自然流产而告终的临床确诊患者中，80%处于胚胎发育早期，且染色体异常占有相当大的比例[20]。据报道绝大多数RSA发生在妊娠早期，一般在孕10周以内[21],本研究中发生在10周以内的RSA患者占41.4%(12/29)，染色体核型异常率为83.3%(10/12)，不排除样本量较小造成的统计误差。本研究还显示，继发性RSA胚胎染色体异常率高于原发性RSA，与以往的研究结果一致[22-23]。其中母体因素如凝血、免疫功能紊乱以及解剖异常可能发挥更显著的作用，使继发性RSA胚胎更易出现异常形态。这些发现可能为RSA患者提供预后信息，同时强调了原发性、继发性RSA潜在的病因不同。在继发性RSA中，由于异常核型的高复发率，可将植入前基因筛查作为一种治疗选择提供给患者[24]。陈洁等[25]对原发性、继发性早期RSA患者进行临床分析，继发性患者内分泌水平、夫妻双方染色体及解剖因素均与原发性早期RSA患者有差异(P<0.05)，提示继发性RSA者可能存在遗传外的因素造成早期胚胎发育异常而导致自然流产。

针对RSA的病因，染色体检测结果对于临床工作者的诊断及患者的妊娠结局尤为重要。虽然传统核型分析是诊断的金标准，但是培养失败、样本微生物感染、产妇细胞污染和染色体制备不良等因素常常导致常规核型分析失败,总体失败率为21%[26]，尤其在RSA妇女中，无论是通过金标准还是分子遗传学测试技术，染色体异常的患病率大不相同[27]，这可能与样本污染、陈旧、培养失败降低检测成功率有关。目前多数观点认为在早期流产中绒毛染色体异常率约50%，也有学者认为染色体异常率的实际情况可能明显高于既往报道数据，这是由于常规细胞遗传学方法分辨率有限，检出率较低。使用基于DNA的方法，包括荧光定量聚合酶链式反应(QFPCR)、染色体微阵列分析(CMA)或NGS，可以避免一些技术难题。本研究中29例RSA样本行NGS检测的成功率高达100%，异常率为75.9%，高于李书平[28]、袁宏涛等[29]传统染色体核型分析方法检测的异常率63.2%、60.8%的结果，其中分别有5例及2例绒毛培养失败。李亚丽等[10]对比分析了绒毛染色体细胞培养G显带分析技术、荧光原位杂交技术(FISH)、NGS技术等3种方法对绒毛细胞染色体的检测结果，认为NGS技术可作为常规染色体核型分析失败的补充检测手段，特别是胚胎停止发育时间长、绒毛组织陈旧、形态极差的样本可以进行NGS技术检测，以提高检测成功率。

值得提出的是，虽然QFPCR相对容易实施，而且价格相对便宜，但并不能检测大部分异常染色体(如染色体15、16和22)。与之相比，CMA或NGS方法的优势在于能够生成更完整的基因图。然而，这两种技术的缺点不仅是成本过高，而且分析结果较耗时[30]。同时，在检测低水平的嵌合体以及三倍体或四倍体时，NGS技术的能力可能受到限制,但是其检测结果的精确性仍是值得肯定的。

总之，本研究表明，NGS技术可以用于检测RSA绒毛组织，且成功率高，在一定范围内能够发现染色体微缺失、微重复。一个结构良好的产前诊断，包括临床、遗传学以及植入前遗传学诊断，尤其是对异常染色体核型的检测，不仅能够协助临床工作者做出准确诊断，而且也能够指导RSA患者实现优生优育，改善妊娠结局。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：所有作者共同参与了论文的研究设计、写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions：All the authors have participated in the research design, writing and revision of the manuscript.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.