鲍博艺 李卫萍，2*

(1.首都医科大学附属北京友谊医院心血管中心，北京 100050；2.代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京 100050)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指急性心肌缺血性坏死，大多是在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉不稳定斑块破裂、糜烂，继发血栓形成导致冠状动脉不完全或完全性闭塞，引起相应部位心肌严重而持久的急性缺血性坏死。尽管目前大多数AMI患者接受了积极的冠状动脉血运重建术以及规范的冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)二级预防治疗，但AMI病死率仍然呈上升趋势[1-3]。《中国心血管健康与疾病报告2020》[1]显示我国2018年城镇与农村居民AMI病死率已分别从2002年的39.56/10万、27.57/10万上升至120.18/10万、128.24/10万，因而探索新的诊疗策略一直是心血管疾病领域研究热点。外泌体是细胞外囊泡的成员之一，可以作为载体运输生物分子，在细胞间传递信号，影响病理生理过程[2]。近年研究[3-5]显示在心肌梗死过程中，外泌体可以发挥心脏保护或心脏损害作用，而miRNA被认为是外泌体能够产生上述作用的主要信号，其被装载在外泌体中，进入靶细胞后可以影响受体细胞的生物学功能[6]。目前，外泌体miRNA被认为在心血管疾病、癌症、神经退行性疾病中发挥重要作用[2]，本文结合近年来的国内外文献对外泌体miRNA在AMI中的研究进展进行综述。

1 外泌体miRNA的概述

1.1 外泌体和miRNA

外泌体是起源于内吞体，直径在40～160 nm的具有脂质双分子层的细胞外囊泡，在血液、尿液、脑脊液等体液中均可存在。它可以包裹蛋白质、RNA(包括miRNA、mRNA、circRNA和lncRNA等)、DNA、氨基酸、代谢产物等物质，通过介导不同组织间的旁分泌和内分泌，在细胞间信号传递、免疫反应等方面发挥作用[2，7-8]。外泌体的释放和有效载荷受各种生理因素和细胞条件影响，包括氧化应激、缺氧和细胞内钙水平等。在发生心肌损伤后，干细胞来源的外泌体也可以提供生长因子、miRNA和细胞保护因子等物质，通过抗凋亡、抗纤维化和促进新生血管生成等作用帮助受损心肌修复再生[9]。

miRNA是约有22个核苷酸的短链、内源性、非编码RNA，与mRNA的3′端的非翻译区(untranslated region, UTR)结合后，通过促进mRNA降解或抑制翻译降低靶基因蛋白表达并调控受体细胞的表型及功能。在心血管疾病中，miRNA可以作为一种新型的诊断生物标志物，并参与细胞增生分化、细胞凋亡、细胞因子合成和转移旁分泌等各种病理生理机制[10-11]。

1.2 外泌体miRNA与其他miRNA

外泌体中有不同类型的RNA，其中miRNA在外泌体中比在分泌外泌体的细胞中更加富集。相较于血浆miRNA，外泌体miRNA受到脂质双分子层保护，在细胞外环境中可以避免RNA水解酶的降解作用，具有更好的稳定性[8]。血浆miRNA在4 ℃保存两周后其RNA含量明显下降，而外泌体miRNA可在4 ℃保存至少两周不降解，在-20 ℃可保存5年。外泌体的膜结构显著增强miRNA分子的稳定性，提升其作为疾病生物标志物的潜力。在大鼠心肌梗死模型中，间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)来源的外泌体和MSC具有相似的miRNA表达谱，其中数种miRNA的表达存在显著差异，促进心梗后心肌修复的作用优于MSC[12]。相较于其他来源的miRNA，外泌体miRNA拥有更高的研究价值。

2 外泌体miRNA在AMI病理生理过程中的作用

2.1 外泌体miRNA与心肌细胞凋亡

近年研究[13-15]表明骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)、心脏成纤维细胞集落形成单位(cardiac colony-forming unit fibroblast, cCFU-F)，M2型巨噬细胞起源等多种来源的外泌体miRNA参与调控心肌梗死后心肌细胞凋亡，发挥心脏保护作用。Peng等[13]构建了小鼠和体外细胞的心肌梗死模型，发现MSC来源的外泌体miRNA-25-3p通过抑制促凋亡基因FASL和PTEN的蛋白表达，减少心肌细胞凋亡，保护心脏功能。此外下调EZH2和H3K27me3水平，导致eNOS和SOCS3基因的表达降低，从而抑制炎性反应。MSC来源的外泌体过表达miRNA-210通过其下游靶点AIFM3、pAKT和p-p53调控心肌细胞的增生和凋亡，增加心肌细胞在缺氧状态下的存活，减少心肌梗死面积及改善心功能[14]。此外，miRNA-21a-5p可以抑制心肌细胞中促凋亡基因PDCD4、PTEN、Peli1和FasL的表达，发挥抗凋亡作用[15]。Zhu等[16]研究发现在缺氧诱导条件下BM-MSC产生的外泌体中，miRNA-125b-5p富集，可以减少促凋亡基因p53和BAK1的表达。GATA4是一种心脏发育早期的特异性转录因子，在过表达GATA4的cCFU-F来源的外泌体中，miRNA-221水平上调，通过PTEN/PI3K/AKT信号通路减弱低氧诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)的凋亡[17]。Ning等[18]证实MSC来源的外泌体miRNA-153-3p通过激活ANGPT1和VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt/eNOS通路抑制心肌细胞及内皮细胞在缺氧状态下发生的凋亡。此外，在AMI小鼠模型中静脉注射分离的M2型巨噬细胞起源的外泌体，可以通过miRNA-1271-5p下调SOX6，减少Bax和c-caspase-3蛋白表达，增加Bcl-2水平，抑制细胞凋亡[19]。Wang等[20]从健康对照者和恢复期AMI患者(发病后3～7 d)中分离血浆外泌体。miRNA测序和PCR分析表明miR-342-3p水平在AMI外泌体中显著下调。miR-342-3p分别通过靶向调控SOX6和TFEB基因抑制H9c2心肌细胞凋亡和自噬，减轻H2O2诱导的心肌损伤。

2.2 外泌体miRNA与新生血管形成

新生血管形成是重建缺血性心肌侧支循环的重要过程。Geng等[21]从AMI患者和冠状动脉造影未见有意义狭窄的受试者血清中分离出外泌体与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)共培养，结果显示AMI组外泌体中miRNA-143含量减少，同时miRNA-143通过胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)通路增加一氧化氮生成，从而促进血管生成。从AMI小鼠分离外泌体后发现，其表达的miRNA-1956可以在脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADMSC)中下调Notch-1，激活VEGF信号，进而影响血管新生[22]。端细胞(cardiac telocyte，CT)是最近在心脏间质中发现的一种新型心脏间质细胞群，Liao等[23]对于CT来源的外泌体研究发现，其miRNA-21-5p通过沉默CDIP1基因，下调其激活的caspase-3，进而抑制微循环血管内皮细胞凋亡，从而促进心肌梗死后血管再生。Zhu等[24]对比了脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, ucMSC)、含巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)的ucMSC和下调MIF的ucMSC 组来源的外泌体在缺血、缺氧条件下对HUVEC和H9C2的作用，发现含MIF的ucMSC来源的外泌体显著促进HUVECs的增生、迁移和血管生成，抑制H9C2心肌细胞凋亡。其中miRNA-133a-3p发挥主要作用，还具有抑制细胞凋亡和心肌纤维化，改善心功能等多种作用。

2.3 外泌体miRNA与心肌纤维化

心肌梗死后心肌纤维化程度会影响心室重构及心脏功能的恢复。Kang等[25]在人外周血来源外泌体中装载miRNA-21模拟物或抑制剂，加入体外H9C2和HL-1细胞培养中，可以调控参与心肌纤维化过程的Smad7、PTEN和MMP2蛋白及mRNA表达水平。体内小鼠AMI模型实验证实miRNA-21可促进心肌纤维化。Pan等[26]将miRNA-146a模拟物和阴性对照转染到脂肪干细胞(adipose-derived stem cell, ADSC)后分离出外泌体，在AMI大鼠模型中发现转染miRNA-146a后可以下调EGR1，抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻心肌纤维化、细胞凋亡和炎性反应。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)来源的外泌体中miRNA-218-5p和miRNA-363-3p数量丰富，分别可以通过上调p53、下调JMY这两条途径，促进成纤维细胞增生和间质-内皮细胞转化，抑制心肌纤维化。在小鼠AMI模型中给予miRNA-218-5p或miRNA-363-3p类似物可以减少心肌梗死面积，促进心梗后心肌修复[27]。AMI后应用沙库巴曲缬沙坦或缬沙坦治疗可增加外泌体的产生，而且沙库巴曲缬沙坦可降低外泌体miRNA-181a数量，减轻心肌纤维化和改善心功能[28]。

2.4 外泌体miRNA与炎性反应

炎性反应是AMI的发生、发展中的关键环节。研究发现小鼠发生心肌梗死后巨噬细胞内miRNA-155前体数量增加，分泌含有miRNA-155的外泌体，可下调SOS蛋白1，减少SOCS1表达，抑制心脏成纤维细胞增生，促进炎性反应，导致心肌梗死后心肌损伤。利用miRNA-155基因敲除小鼠建立AMI模型，与野生型小鼠相比，心肌梗死后心功能受损程度轻，心脏破裂发生率更低[3]。Wei等[29]研究结果显示，MSC外泌体miRNA-181a既抑制c-Fos和促炎因子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-6]表达，又增加调节性T细胞和抗炎因子IL-10水平。此外，MSC外泌体miRNA-182和CDC外泌体miRNA-181b分别通过抑制TLR4和PKCδ两种途径，促进巨噬细胞由M1型转变成M2型，进而减少心肌梗死后心肌缺血再灌注损伤[30]。Liu等[31]发现脂多糖刺激的BM-MSC中外泌体miRNA-181a-5p表达增加，通过外泌体将miRNA转移至H9c2细胞，可增加H9c2细胞中miRNA-181a-5p表达，进而下调ATF2，抑制心肌炎性反应和氧化应激反应。

3 外泌体miRNA在AMI中的临床应用

3.1 早期预测和诊断

Chen等[32]对AMI患者和健康受试者的外周血外泌体进行miRNA测序，发现与健康对照组相比，AMI 组术前有544个miRNAs表达上调，518个miRNAs表达下调，其中miRNA-6718和miRNA-4329表达显著降低。AMI患者在PCI术后3 d miRNA-6718的表达明显高于术前，表明miRNA-6718和miRNA-4329有望成为AMI的生物标志物，其敏感度是否优于cTnT和CK-MB，仍需进一步研究。Ling等[33]发现ACS患者的血清外泌体miRNA-126和miR-21表达显著高于健康对照组。受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线表明两者均可作为AMI的新型候选诊断生物标志物，较肌钙蛋白具有更好的特异性。Su等[34]对AMI和稳定性冠心病患者外泌体进行miRNA微阵列分析，进而采用qRT-PCR进行验证，结果表明miRNA-1915-3p、miRNA-4507和miRNA-3656可作为AMI的预测标志物，曲线下面积(area under curve，AUC)分别为0.772、0.684和0.771，且具有较高的特异度和敏感度。Guo等[35]对稳定性冠心病患者，AMI患者，健康受试者共118例的血浆外泌体进行分析后，发现有18种miRNA可作为早期AMI诊断生物标志物。此外，AMI后外泌体纳米颗粒浓度没有变化，而纳米颗粒直径明显减小，但其能否作为一种快速稳定的AMI筛查方法有待进一步研究证实。

3.2 冠状动脉狭窄严重程度和预后

Zhao等[36]发现外泌体miRNA-183表达水平在健康对照组，稳定型心绞痛组和AMI组逐渐升高，因此认为外泌体miRNA-183水平与心肌损伤程度呈正相关，同时也可作为诊断心肌缺血性损伤的生物标志物。GO和KEGG分析表明，miR-183主要通过调控5个核心基因(PPP2CB、PPP2CA、PRKCA、PPP2CA、PPP2R5C和PPP2R2A)，参与心肌细胞的细胞通讯、蛋白激酶活性调节和肾上腺素能信号传导。Gensini评分是根据冠状动脉造影显示的部位和狭窄程度来量化冠状动脉狭窄的严重程度的指标。研究[33]显示外泌体miR-126在不稳定型心绞痛和AMI患者中的表达水平与Gensini评分呈正相关，可以作为一种无创诊断方法来评估冠状动脉狭窄的程度。一项在接受急诊PCI术的STEMI患者中进行平均20.8个月的随访研究[37]发现，miRNA-122-5p/133b比值升高的患者发生死亡或再梗的风险增加9倍，发生复合心血管不良事件的风险增加4倍，具有评估长期心血管预后的重要价值。

3.3 治疗

近十多年来外泌体和miRNA的研究发现促进了针对心血管疾病的基因靶向治疗。基因治疗所要传递的生物分子在体内极不稳定，在到达靶细胞之前易被核酸酶破坏或降解，难以到达靶病变部位发挥作用，因此需要选择高效、安全的基因传递载体。与目前常用的病毒类载体相比，外泌体作为药物传递载体具有较强的膜稳定性、靶向性和高效性。如前所述，Wang等[20]研究发现miRNA-342-3p在AMI恢复期患者的血浆外泌体中表达下调，对受损心肌恢复及心功能改善将产生不良影响。外泌体miRNA-342-3p可以通过靶向SOX6介导细胞凋亡，同时通过TFEB介导的自噬减轻心肌损伤，因此可以将miRNA-342-3p作为心肌梗死患者潜在的治疗靶点。Wei等[29]通过心肌内注射MSC来源外泌体，利用外泌体的靶向功能将miRNA-181a传递到小鼠心脏组织，增强miRNA-181a增加调节性T细胞和抗炎因子水平，从而减轻心肌梗死后的再灌注损伤。Chachques等[38]将巨噬细胞和富含外泌体的MSCs接种在弹性支架表面，通过增加miRNA-124表达和降低miRNA-125表达，增加巨噬细胞M2表型及细胞外基质组成成分I型胶原和卵黄连蛋白，提高心肌修复和再生能力。Zhu等[16]通过生物正交化学方法将在缺氧诱导条件下BM-MSC产生的外泌体与缺血心肌靶向肽进行结合后，静脉注射到心肌梗死小鼠体内，可以特异性靶向作用于受损心肌的缺血部位，并借助缺氧时外泌体来源的miRNA-125b-5p减轻心肌梗死面积，提高左室射血分数。

尽管近年研究[30-32]提示外泌体miRNA有望于成为AMI的治疗新策略，但仍集中在动物实验或体外细胞实验。由于外泌体miRNA的给药方式、代谢途径、最佳剂量及安全性等方面尚不确定，因此限制了其用于人体的临床研究。目前一项关于AMI患者冠状动脉内输注纯化外泌体安全性评价的研究[39](NCT04327635)已经在美国进入了Ⅰ期临床试验，期待该研究结果能为外泌体在AMI中的临床应用提供初步证据。

近年的研究[36-38]表明外泌体miRNA 与AMI的发生、发展密切相关，外泌体中差异表达的 miRNA 和蛋白质分子可作为早期预测或诊断AMI的生物标志物。同时基于外泌体的低毒性、生物相容性、低免疫抑制性、膜稳定性等特点，可以装载特定miRNA通过不同的信号通路促进新生血管形成及梗死心肌的修复，从而改善心脏功能及临床预后，具有潜在的临床治疗应用前景，但给药方式和剂量以及人体内应用的安全性仍需要深入的基础和临床研究进一步验证。目前关于外泌体miRNA在AMI中的研究尚处于起步阶段，相信随着医学技术的发展，将有更多关于外泌体miRNA在AMI中的探索研究，从而为心肌损伤修复提供更有效的治疗靶点。