罗 晶，胡 帅，杨标斌，李 信，欧阳玲花，周巾英，袁林峰，祝水兰*

（1.江西省农业科学院 农产品加工研究所，江西 南昌 330200；2.江西省检验检测认证总院 工业产品检验检测院，江西 南昌 330200）

目前我国富硒稻米的种植面积不断扩大，但富硒大米深加工仍处于初级加工状态，在加工技术和经济效益上与发达国家存在很大差距。硒蛋白具有良好的生物活性，主要包括抗氧化活性、免疫调节、神经保护活性和抑制高血糖活性等［1-3］。硒是人和动物的必需微量元素之一，具有调节心血管、提高免疫力和抗癌防癌等作用［4］，硒蛋白在人体内发挥着降低重金属毒害等特殊生理功能［5］。富硒蛋白是无机硒的潜在替代品，不仅具有蛋白质的结构性质，而且具有硒的理化性质［6］。基于此，开发一种科学、定量补硒的富硒蛋白粉已成为目前的迫切需求，同时在深加工中减少硒的流失，从而提高富硒稻米的经济附加值及硒元素的利用率，提升我国稻米深加工的技术水平和综合利用水平。

目前，硒蛋白的提取方法主要包括溶剂提取（水、盐、乙醇、酸、酶和碱溶液萃取）、电泳分离萃取、TRIzol结合阴离子交换柱萃取、超声辅助提取和脉冲电场辅助提取等［7］。梁潘霞等［8］以富硒大米为原料，采用碱提法提取硒蛋白，最佳提取条件为：提取温度50 ℃、碱液浓度0.14 mol/L、提取时间5 h、料液比1∶30，硒蛋白提取率为57.11%。王克铁等［9］以米渣磨浆，采用超声与高压均质法结合处理，得到蛋白液，浓缩干燥后获取蛋白粉。Liang等［10］使用100 Hz超声波清洗器辅助，料液比1∶15的NaOH 0.05 mol/L，DL-二硫苏糖醇2.5%和0.5%亚硫酸钠，40 ℃提取4 h，经冷冻干燥，获得蛋白粉。Wu等［11］比较了4种提取方法（水提取、脉冲电预处理+水提取、超声辅助提取和脉冲电预处理+超声辅助提取）对富硒小豆蔻的蛋白质和硒含量的影响，其中超声辅助提取方法产生的蛋白质纯度最高（77%）和总硒含量（9097.33±35.66 mg/kg）。溶剂提取法由于其高效率和低成本而受到广泛推广，但是同时也存在着硒蛋白严重流失的问题。因此，研究一种高效提取硒蛋白的方法具有广阔的市场推广价值。

本研究使用富硒稻米生产中的碎米为主要原料提取硒蛋白。采用超声波细胞粉碎与碱法联用提取硒蛋白，并分析其硒形态。通过配制碱提液来高效断裂蛋白质分子的二硫键，再用酸调等电点使硒蛋白析出沉淀并获取硒蛋白。此方法解决了缺硒地区补硒的问题，高效、便捷地提取出了具有高营养价值的碎米硒蛋白，该硒蛋白可用作营养辅料或营养强化剂，具有较高的利用价值。探究了超声波碱法提取富硒大米中硒蛋白的效果，并获得提取的最佳工艺条件，为提高硒蛋白资源的开发利用及增加营养食品的附加值、多样性和便捷性提供了有力的支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒大米用粉碎机粉碎至全部通过100目筛孔，密封置于干燥器中备用；试验用水均为超纯水；盐酸、氢氧化钠采购自国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

使用的实验仪器设备包括XL-200A型粉碎机（上海润实电器有限公司）、TP-214型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、UP250型超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、WZJ-12B型超微粉碎仪（济南天方机械有限公司）、B-260型恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）、SHA-B型水浴恒温振荡器（常州润华电器有限公司）、LGJ-18真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、HJ-4B数显恒温测速磁力搅拌器（金坛区金城晶泽实验仪器厂）、PHS-3C雷磁pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、SY-3000A型磨粉机（善友机械设备有限公司）、EYELA旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 富硒大米硒蛋白等电点pH值的测定 将富硒大米加工产物碎米粉碎，加入NaOH溶液混匀。采用5000 r/min转速下离心30 min，使淀粉充分沉淀，分别取出上清液20 mL，放入7个50 mL的小烧杯中用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液将烧杯中溶液的pH值分别调节为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。取7个洁净并已称质量（m0）的离心管，分别将上述烧杯中的溶液放于离心管中称量质量（m1），然后在5000 r/min转速下离心30 min，将上清液小心倾入另一试管中，并测定上清液中的蛋白的质量浓度，同时称量离心后沉淀与离心管的质量（m），并计算沉淀率，计算公式如下：

1.3.2 富硒大米硒蛋白提取工艺 将富硒大米碎米粉碎得到大米粉末，加入一定量的碱液混匀，经超声波细胞粉碎仪及磁力搅拌器搅拌一定的时间，所得浆液在5000 r/min转速下离心30 min，然后将pH值调至等电点4.5，倒出上清液，将沉淀物的pH值调至中性，经冷冻干燥得富硒大米蛋白粉。

1.3.3 单因素试验 固定超声波功率190 Hz，料液比1∶8，NaOH浓度0.4%，提取时间2 h。分析不同的超声波功率（130、160、190、220、250 Hz）、料液质量体积比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）、NaOH浓度（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、提取时间（1、2、3、4、5 h）对硒蛋白提取的影响。

1.3.4 Box-Behnken试验设计 在单因素试验的基础上，应用Design-Expert 8.0.6软件选择对硒得率有显著影响的因素，应用Box-Behnhen设计硒得率为响应值，从中筛选出提取硒蛋白的最优条件。响应面因素水平设计如表1所示。

表1 Box-Benhnken试验设计的因素水平

1.3.4 硒蛋白提取率的计算 上清液中的蛋白质量浓度测定使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，采用G250染色液试剂比色法。采用酶标仪在波长595 nm处测定吸光度值，再用牛血清蛋白制作标准曲线，并求曲线回归方程，从而算出总蛋白质含量；硒蛋白质测定采用GB 5009.5—2016食品中的蛋白质的测定；硒含量测定采用氢化物原子荧光光谱法，按照GB 5009.93—2017中的方法测定硒含量。硒得率和硒蛋白提取率的计算公式如下所示：

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，结果取平均值。应用SPSS 24软件进行Anova和Duncan检验，以确定平均值之间的显著性差异（P＜0.05）；应用Origin 8.6软件进行数据制图；应用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 大米硒蛋白等电点的测定

2.1.1 牛血清蛋白的标准曲线 牛血清蛋白质的标准曲线如图1所示，在标准品浓度0～1.5 mg/mL范围内与吸光度线性关系良好。

图1 蛋白标准曲线

2.1.2 大米蛋白质等电点pH值的测定 在等电点pH条件下，蛋白质在溶液中的溶解度最小，产生的沉淀量最大。由图2可知，在不同pH值条件下，蛋白质含量呈先升高后降低的趋势。在pH值为5.5条件下的硒蛋白沉淀量较大；pH值为3.5条件下的沉淀率最大（7.0%），且上清液中的蛋白含量达到最低（0.11 mg/mL），硒蛋白的等电点的pH值为3.5。由于等电点条件下的蛋白质分子颗粒在溶液中不存在同电荷的相互排斥作用，其蛋白质分子颗粒极易相互碰撞、凝聚而析出沉淀。因此，在该等电点条件下溶液中蛋白质的溶解度最小［12］。由本试验的结果可以得出，硒蛋白的等电点为3.5。

图2 pH值对富硒大米蛋白含量及沉淀率的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 超声波功率对大米蛋白提取率及硒得率的影响 在硒蛋白提取过程中，结合超声波细胞粉碎仪可大幅提高蛋白质的产出率。由图3可知，随着超声波功率升高，硒蛋白提取率先升高后降低。当超声波功率为220 Hz时，硒蛋白提取率为50.6%，硒得率为98.17%；在超声波功率为250 Hz时，硒蛋白提取率为49.91%，硒得率为99.43%。因此，当超声波功率为220 Hz时，硒蛋白提取率最高。这说明超声波通过机械效应、空化效应和热效应提取蛋白质，可显著促进蛋白质的溶解，从而提高蛋白质的提取速率［13］。加大超声波功率，可强化超声空化作用和机械剪切作用，有助于大米蛋白的溶出。但随着功率增加，上述作用效应会出现负效应，如当功率达220 Hz后，硒蛋白提取率出现了略微下降。综上，设定220 Hz为最适的超声波功率。

图3 超声波功率对硒蛋白提取率及硒得率的影响

2.2.2 料液比对大米蛋白得率及硒得率的影响 由图4可知，硒蛋白提取率和硒得率随料液比增大呈先增后降的趋势，当料液比为1∶10时，硒蛋白提取率和硒得率最大，分别为50.93%、99.86%。当液料比较低时，提取液的黏度较大，分子扩散速率较低，蛋白分子的溶出速率较低，且蛋白质量浓度较高，分子间的相互斥力会阻碍更多蛋白的溶出［14］。随着液料比的增加，稀释作用加强，提取液的黏度和蛋白质量浓度均有所下降，蛋白的溶出增加，提取率升高。当料液比为1∶10条件下，蛋白能够充分析出，此时蛋白收率达到最大。当继续增大料液比时，溶液中蛋白质浓度较低，泡沫稳定性较差，蛋白质得率降低［15］。

图4 料液比对硒蛋白提取率及硒得率的影响

2.2.3 碱浓度对大米蛋白提取率及硒得率的影响 由图5可知，随着碱浓度增加，硒蛋白提取率与硒得率呈先增后降趋势。当碱浓度为0.4%时，硒蛋白提取率和硒得率最大，分别为49.36%、99.43%。大米蛋白在胚乳中与淀粉结合紧密，较难溶出。NaOH能够有效提高蛋白的溶解性，其可以破坏蛋白分子中的二硫键、氢键和酰胺键，使蛋白质的溶解性上升，提高了蛋白质的提取产率［16］。当碱浓度超过0.4%后，由于淀粉部分糊化，使溶液黏度增加，导致蛋白无法被提取出来，蛋白提取率下降。因此最适的碱浓度为0.4%。

图5 碱浓度对硒蛋白提取率及硒得率的影响

2.2.4 提取时间对大米蛋白提取率及硒得率的影响 由图6可知，随着提取时间的增加，硒蛋白提取率与硒得率均呈先增后降趋势。当提取时间为2 h时，硒蛋白提取率和硒得率最大，分别为55.74%、99.98%。提取时间较长和过高浓度的碱液会使得蛋白质的半胱氨酸和丝氨酸结合形成赖丙氨酸，导致营养物质损失［17］。因此使用超声波细胞粉碎仪和磁力搅拌器辅助，可缩短碱液提取时间，降低碱液浓度，提高硒蛋白提取率。当提取时间超过2 h时，出现了蛋白质凝聚沉积现象，导致了蛋白提取率降低［18］。

图6 提取时间对硒蛋白提取率及硒得率的影响

2.3 响应面试验结果分析

从单因素试验的结果可得，超声波功率220 Hz、料液比1∶10 g/mL、碱浓度0.4%、提取时间2 h分别为各单因素下的最佳提取硒蛋白条件。在单因素的基础上，以硒蛋白的提取率为评价指标，对超声波功率、料液比、碱浓度、提取时间进行四因 素三水平的响应面优化设计，结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

2.3.1 回归方程及参数分析 通过Design-Expert 8.05软件对表2的试验结果进行数据拟合，得到二次多元回归方程：

Y=57.44+1.55A+1.15B+1.13C-1.18D-0.35AB+ 1.15AC-1.50AD+1.38BC+1.34BD+0.013CD-2.96A2-4.19B2-8.52C2-3.73D2。

该模型的显著性分析见表3，由方差分析结果可知，模型F=89.16，该回归模型P＜0.0001，说明该回归差异极显著；方程失拟项F=3.46、P＞0.05，表明失拟项对纯误差的影响不显著；该模型的决定系数（R2）为0.9778，校正决定系数（R2adj）为0.9409，说明该回归方程与试验拟合度良好，其他因素对试验结果的干扰小；根据F值可知，影响富硒大米蛋白提取率的4个因素的大小顺序依次为碱浓度、料液比、超声功率、提取时间；根据P的变化可知，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、BC和AD对硒蛋白提取率影响极显著（P＜0.01）。

表3 显著性分析

续表3：

2.3.2 提取工艺优化及验证试验结果 应用Design-Expert 8.06软件分析得出大米蛋白提取的最佳工艺参数为：碱浓度0.14%、料液比1∶10、超声波功率220 Hz、提取时间2 h。该条件下大米硒蛋白提取率为57.44%，对优化参数进行了3次重复验证试验，得大米硒蛋白提取率为57.95%，与预测值非常接近，证实了该回归模型用于提取大米硒蛋白具有较高的可靠性。

3 结论

在单因素试验的基础上，运用响应面分析法对富硒大米蛋白的提取条件进行优化。各因素对大米蛋白得率的主次因素为：NaOH浓度＞料液比＞超声功率＞提取时间，验证试验进一步得到在超声波功率220 Hz，碱液浓度0.4%，提取时间2 h，料液比1∶10条件下，大米硒蛋白提取率达到57.95%。本试验结果可为规模化提取大米硒蛋白提供参考，但其理化性质还有待进一步深入研究。