周 琴，刘 健，孙艳秋，陈晓露，张先恒，丁 香

安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230012

类风湿关节炎（RA）患病率高达1%［1］，其主要表现为对称性多关节炎，是一种常见的自身免疫性关节炎。在RA的病理变化过程中，越来越多的证据证明，滑膜成纤维细胞（FLS）起着关键的作用。RA-FLS具有包括细胞增殖的增加、大量促炎细胞因子的分泌，以及促进迁移等的肿瘤样特性，进而引起局部和全身炎症［2-4］。RA以其病程长，不可治愈、病情难愈，并且在疾病发展过程会有致残的风险等特点，严重降低患者的生活质量，伴随着不同程度的患者感受（SPP）的改变，在临床研究中患者感受和疾病的发展、药物的干预作用的关联越来越受关注［5,6］。

在RA 的复杂发病机制中miRNAs 起着关键作用［7-9］。作为miR-342 家族中的一员，miR-342-3p是定位于14 号染色体14q32 上的一段非编码序列，位于宿主基因EⅤL 的第3 个内含子中［10,11］。目前国内外关于miR-342-3p在RA中研究不多，既往仅有少量研究报道miR-342-3p的异常表达可能与RA的免疫炎症相关［12］，但未见与RA 患者临床指标相关分析。本研究关联规则分析miR-342-3p与RA患者临床指标的相关性，并纳入患者感受指标，研究miR-342-3p 的表达与焦虑抑郁指标的相关性，及探索其对滑膜细胞炎症和迁移的影响。

本研究旨在观察miR-342-3p在RA患者中的表达，分析其与临床指标、患者感受的相关性，然后通过体外培养RA-FLS，探究miR-342-3p干扰或过表达状态下对RA-FLS炎症和迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 病例来源

50例RA患者来自安徽中医药大学第一附属医院风湿免疫科住院患者（2021年3月～2022年6月），其中男性9 例，女性41 例，年龄52（48，65.25）岁；病程为7（2.75,17.25），30例正常对照者（HC）来自同一时间安徽中医药大学第一附属医院健康体检中心，其中男性3例，女性27例，年龄53（47.75，61.25）岁，两组基线比较一致，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。本研究经安徽中医药大学第一附属医院科学研究伦理委员会批准（2019AH-12）。

表1 两组受试者一般情况Tab.1 General information of subjects in the two groups

1.2 诊断及纳入标准

1.2.1 诊断标准 西医诊断标准：所有患者均符合2010年美国风湿病学会(ACR)联合欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的RA诊断标准［12］。

1.2.2 纳入标准（1）符合上述诊断标准；（2）年龄在18～70岁之间；（3）所有患者均签署知情同意书。

1.2.3 排除标准（1）不符合上述诊断标准；（2）合并有心、肝、肾等严重疾病的患者；（3）年龄在18岁以下，70岁以上者；（4）孕妇或正值哺乳期的女性；（5）观察期间应用生物制剂的患者；（6）关节严重畸形，完全丧失关节功能的患者；（7）合并有精神病，不能配合治疗的患者。

1.3 观察指标

1.3.1 免疫炎症指标 类风湿因子（RF），抗环瓜氨酸肽抗体IgG（anti-CCP），血沉（ESR），超敏C反应蛋白（hs-CRP），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白（IgM），补体C3（C3），补体C4（C4）。

1.3.2 患者感受指标 28个关节疾病活动度评分（DAS-28）、焦虑自评量表（SAS），抑郁自评量表（SDS）。

1.4 RA-FLS培养

将培养的RA患者滑膜成纤维细胞[赛百慷（上海）生物技术股份有限公司]用PBS洗2次，在37 ℃的温度下，加入1 mL胰酶，显微镜下观察到细胞明显收缩，变圆后，加入新鲜培养基终止消化，移液枪吹打，使细胞脱落，收集细胞至15 mL离心管，以1000 r/min的转速，超速离心5 min，再弃上清，加入适量新鲜DMEM培养基重悬，继续进行细胞传代培养，并收集备用。

1.5 实验分组与细胞转染

取对数生长的传代培养的RA-FLS细胞铺板在六孔板里面，待细胞贴壁后进行如下分组的处理：（1）RA-FLS 组：细胞不做任何处理；（2）TNF-α+RA-FLS组：20 ng/mL TNF-α刺激细胞24 h；（3）TNF-α+RAFLS+mimics-NC：20 ng/mL TNF-α刺激细胞24 h后转染mimics-NC 48 h；（4）TNF-α+RA-FLS+mimics-miR-342-3p：20 ng/mL TNF-α刺激细胞24h后转染mimics-NC 48 h；（5）TNF-α+RA-FLS+inhibitor-NC：20 ng/mL TNF-α刺激细胞24 h后转染inhibitor-NC 48 h；（6）TNFα+RA-FLS+inhibitor-miR-342-3p组：20 ng/mL TNF-α刺激细胞24 h后转染si-miR-342-3p 48 h。根据制造商的说明，将mimics-miR-342-3p、inhibitor-miR-342-3p与各自阴性对照转染至RA-FLS中，继续孵育48 h。

其中mimics-miR-342-3p、inhibitor-miR-342-3p与各自阴性对照购自上海GenePharma。

1.6 实验试剂及仪器

DMEM 培养基（Hyclone）；Transwell 小室（Millicell）；胎牛血清（浙江天杭生物公司）；二甲基亚砜（Sigma）；ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技公司）；PBS（BI）；超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司），荧光定量PCR 仪（Thermo Scientific），培养箱（Thermo），普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；荧光显微镜(Motic)等。

1.7 实验方法

1.7.1 RT-qPCR检测miR-342-3p的表达 收集外周血单个核细胞、RA-FLS做RT-qPCR检测，Trizol提取各组细胞总RNA，逆转录、扩增、琼脂糖凝胶电泳，再采用Gelpro32 凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析，以U6表达量为参照采用2-△△Ct进行相对定量分析（表2）。

表2 RT-qPCR定量分析miR-342-3p引物Tab.2 Primers for RT-qPCR amplification of miR-342-3p and U6

1.7.2 ELISA 检测 采用ELISA 方法，收集以上各组RA-FLS 培养的上清液，以2000 r/min 的转速离心20 min，再弃沉淀。将上清液加入酶标板中，37 ℃温度下孵育1.5 h，严格按照各试剂盒说明书进行操作，检测介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的表达。

1.7.3 CCK8检测RA-FLS细胞活力 将RA-FLS细胞接种到96孔板中并培养。将培养板在培养箱中分别孵育0、24、48 h，每孔加入10 μLCCK-8溶液，避免气泡生成，将培养板置于培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.7.4 Transwell检测RA-FLS细胞迁移 在37 ℃和5%CO2条件下，将transwell小室放入培养板中，将RA-FLS细胞消化后，洗涤、重悬，取100 μL细胞悬液置于上室，下室盛装800 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，以聚碳酸酯膜相隔，培养48 h，加入PBS缓冲液，固定、结晶紫染色，随机取3个视野。

1.8 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计学处理，符合正态分布，则采用两独立样本t检验，并采用均数±标准差表示；不符合正态分布，则采用秩和检验，并采用四分位数间距表示。多组数据比较采用one-way ANOⅤA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者的临床特征

RA患者的DAS28评分为4.80（4.20，5.40）分，SAS评分为48.75（35，62.75）分，SDS 评分为58.75（53.75，67.50）分。与健康对照组（HC）对比，RA患者免疫炎症指标RF、ESR、anti-CCP、hs-CRP均显著升高（P＜0.01），差异有统计学意义；而两组IgA、IgG无明显差异，IgM、C3、C4差异无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 受试者临床指标特征Tab.3 Clinical data and SPP of RApatients

2.2 MiR-342-3p在RA患者中的表达

与正常组相比，miR-342-3p在RA患者PBMCs中表达显著降低（图1A）；ROC曲线结果显示，曲线下面积为97.53%（P＜0.0001），95%的置信区间为0.9495～1，其中精确度为96.67%，灵敏度为86%，Cut-off 值为0.535（图1B），说明miR-342-3p可作为RA协助诊断标志物。

图1 MiR-342-3p在RA患者中的表达Fig.1 Expression of miR-342-3p the PBMCs of RA patients.A:Expression of miR-342-3p in PBMCs of healthy controls and RApatients detected by qRT-PCR.B:ROC curve.***P＜0.01.

2.3 MiR-342-3p与RA患者免疫炎症指标及患者感受指标的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，RA患者miR-342-3p与RF（r=-0.321）、ESR（r=-0.284）、anti-CCP（r=-0.355）、hs-CRP（r=-0.320）、C3（r=-0.294）、DAS-28（r=-0.395）、SAS（r=-0.366）、SDS（r=-0.397）呈显著负相关（P＜0.05，图2）。

图2 MiR-342-3p与RA患者临床指标的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of miR-342-3p and clinical indicators in RApatients.

2.4 MiR-342-3p与RA患者临床指标的关联规则分析

关联规则结果显示，miR-342-3p的降低与RA患者anti-CCP、DAS-28、SDS、SAS的升高有较强的关联，规则支持均大于85%、置信度均大于88%和提升均大于1（表4）。

表4 MiR-342-3p与RA患者临床指标的关联规则分析Tab.4 Analysis of association rules between miR-342-3p and clinical indicators in RApatients

2.5 MiR-342-3p对RA-FLS细胞活力的影响

通过qRT-PCR检测miR-342-3p的表达，我们成功转染了mimics-miR-342-3p或inhibitor-miR-342-3p在RA-FLS中（图3A）。为了探讨miR-342-3p对TNF-α诱导的RA-FLS的影响，使用CCK8检测RA-FLS的细胞活力，与RA-FLS组对比，TNF-α刺激后RA-FLS细胞活力显著升高（P＜0.05）；与mimics-NC 组相比，mimicsmiR-342-3p组细胞活力显著降低（P＜0.05）；与inhibitor-NC组相比，inhibitor-miR-342-3p组细胞活力显著升高（P＜0.05）；并且24h时细胞活力变化最明显（图3B）。

图3 MiR-342-3P对细胞活力的影响.Fig.3 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on viability of cultured RA-FLS.A:Verification of miR-342-3p expression in RA-FLS after transfection using qRT-PCR.B:CCK8 assay for assessing cell viability at 0,24,and 48 h after transfection.*P＜0.05 vs blank control group;#P＜0.05 vs mimics-NC group,P＜0.05;and^P＜0.05 vs inhibitor-NC group.

2.6 MiR-342-3p对RA患者PBMCs中细胞因子表达的影响

与RA-FLS 组对比，TNF-α刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著升高，IL-10的表达显著降低（P＜0.05）；与mimics-NC 组相比，mimics-miR-342-3p 组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低，IL-10 的表达显著升高（P＜0.05）；与inhibitor-NC组相比，inhibitor-miR-342-3p组IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著升高，IL-10的表达显著降低（P＜0.05，图4）。

图4 MiR-342-3p对细胞因子的影响Fig.4 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on production of IL-1β(A),IL-6(B),IL-10(C)and TNF-α(D)in cultured RA-FLS.*P＜0.05 vs RA-FLS;#P＜0.05 vs mimics-NC;^P＜0.05 vs inhibitor.

2.7 MiR-342-3p对RA患者滑膜细胞迁移的影响

采用Transwell检测细胞迁移功能，采用0.1%结晶紫染色，结果显示，与RA-FLS相比，TNF-α刺激后，细胞迁移能力显著增强（P＜0.05）；与mimics-NC 组相比，mimics-miR-342-3p组细胞迁移能力显著减弱（P＜0.05）；与inhibitor-NC组相比，inhibitor-miR-342-3p组细胞迁移能力显著增强（P＜0.05，图5）。

图5 MiR-342-3p对RA患者滑膜细胞迁移的影响Fig.5 Effect of modulation of miR-342-3p expression levels on migration of RA-FLS(crystal violet staining).

3 讨论

在RA的发病过程中始终伴随着炎性细胞的浸润，FLS是滑膜细胞的主要组成部分，是滑膜关节的间充质细胞［12］，是一种炎性细胞，FLS在RA中过度激活，分泌大量炎性细胞因子，加重疾病的发展［13］。炎性信号的刺激可以使FLS异常增殖、凋亡不足，从而产生多种炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β等，产生的炎性因子反过来又不断地激活FLS，两者相互促进，形成恶性循环［14,15］。

欧曼颖等［16］发现，miR-342-3p上调后，子痫前期的胎盘组织中滋养细胞增殖和迁移等能力明显降低。朱亚蕊等［17］发现，miR-342-3p在非小细胞肺癌中表达下调，通过过表达进而影响非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移等。本研究以miR-342-3p 为研究对象，通过35 例RA患者和30例正常对照组的小样本的临床验证发现，miR-342-3p 在RA 患者PBMCs 中表达显著降低（P＜0.05），ROC 曲线结果表明，miR-342-3p 的AUC 为84.76%，说明miR-342-3p具有潜在诊断价值；有研究发现［11,18-21］miR-342-3p在鼻咽癌细胞和组织中、多发性骨髓瘤细胞、自身免疫性肝炎等均呈低表达状态，miR-342-3p 低表达与乳腺癌内分泌治疗的耐药性相关。miR-342-3p在牦牛卵母细胞减数分裂成熟中起着至关重要的作用。

相关性分析结果显示，RA患者miR-342-3p与炎症指标：RF、ESR、anti-CCP、hs-CRP、C3及患者感受指标：DAS-28、SAS、SDS具有显著相关性（P＜0.05）；关联规则结果表明，miR-342-3p与炎症指标：anti-CCP，及患者感受指标：DAS-28、SDS、SAS具有较高的规则支持、置信度和提升。有研究发现抑郁、焦虑、慢性疼痛和阿片类药物使用在炎症性关节炎患者中很常见［22］。Cozad Melanie等［23］通过对15名诊断为RA的患者的随访调查发现，RA患者伴有不同程度的消极情绪。本研究发现RA患者不仅伴有免疫炎症的异常，还会有一定程度的焦虑抑郁，而这些患者感受指标的升高与miR-342-3p的降低有一定的相关性及关联性。

研究结果显示，对RA-FLS 的刺激以20 ng/mL浓度的TNF-α在24 h最佳，经TNF-α 刺激后，细胞活力显著上升，同时促进了促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，并抑制了IL-10的表达，及滑膜细胞的迁移。为了进一步探究miR-342-3p在RA中发挥的潜在机制作用，我们在RA-FLS中进行了体外实验，以TNF-α+RA-FLS为模型。通过构建miR-342-3p的过表达质粒和小干扰RNA，转染至FLS中，inhibitor-miR-342-3p组miR-342-3p表达显著降低，mimics-miR-342-3p组miR-342-3p表达显著升高（P＜0.05），说明转染成功。ELISA 结果显示，inhibitor-miR-342-3p组促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达显著升高、抑炎因子IL-10表达下降，mimics-miR-342-3p组促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达显著下降，抑炎因子IL-10表达上升（P＜0.05）。此外，我们采用transwell小室检测的细胞的迁移，发现mimics-miR-342-3p组细胞迁移能力显著减弱，而inhibitor-miR-342-3p组细胞迁移能力显著增强（P＜0.05），说明miR-342-3p对滑膜细胞的迁移有一定的抑制作用，并且有研究表明［24-26］，miR-342通过调节炎症和细胞死亡来控制结核分枝杆菌的易感性。通过靶向MAP1LC3B抑制促生存自噬和通过肿瘤抑制基因去甲基化和再表达下调DNMT1来介导对B细胞淋巴瘤的抑制作用；过表达miR-342-3p对宫颈癌细胞系的增殖、迁移和侵袭有一定的抑制作用。

综上所述，本研究表明，miR-342-3p在RA患者中低表达，与免疫炎症指标、SPP具有显著相关性，及较强的关联。MiR-342-3p是参与RA发病的重要miRNA，通过调控RA-FLS炎症以及迁移，参与RA的发病机制，可作为RA潜在诊断靶点。