李 超，陈双江，姜业臻

1清华大学附属北京清华长庚医院肝胆胰外科，北京 102218；2安康市人民医院普通外科，陕西 安康 725000；3西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西 西安 710061；4通用环球西安北环医院普通外科，陕西 西安 710032

肝细胞癌（HCC）具有生长速度快、易发生脉管侵犯和肝内外转移的特点，目前已成为我国致死率最高的恶性肿瘤［1］。MicroRNA（miRNA,miR）是一种长度小于22个碱基的单链非编码RNA，miRNAs的异常表达在HCC发生发展中发挥关键作用［2］。MiR-607位于人类10号染色体，最早在抗埃博拉病毒相关miRNA中［3］被发现，随后miR-607被发现与神经精神疾病［4,5］及多种癌症［6,7］的进展密切相关。胰腺癌中，血清miR-607低表达患者出现淋巴结转移、肝脏转移和周围神经侵犯比例更高、预后更差［8］，体外过表达miR-607能够抑制胰腺癌细胞增殖和迁移［9］，提示miR-607在胰腺癌中具备液体活检标志物价值并能发挥抗癌作用。目前，仅通过测序发现HCC患者血清外泌体miR-607表达水平降低［10］，但HCC组织中miR-607的表达和具体生物学功能尚缺乏研究。因此，本研究拟通过探讨miR-607在HCC中异常表达的临床意义和调节HCC生长转移的功能机制，以期明确miR-607在HCC疾病进展中的作用。

1 资料和方法

1.1 资料

收集2019年1月1日～2021年1月1日于安康市人民医院普通外科行手术切除的HCC组织及对应癌旁组织标本45例，包括男性29例，女性16例，年龄50～77岁，中位年龄63岁。所有患者术前均未接受过靶向、介入、放化疗等辅助治疗并且均签署知情同意书，实验方案由西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核批准（批号：2021 伦审科字第347 号）。MicroRNA 模拟物（mimics，miR-607及阴性对照）、microRNA PCR扩增引物试剂盒（miR-607及U6）、野生型及突变型TRPC5 mRNA 3'-非翻译区（3'-UTR）双荧光素酶报告基因系统由广州锐博生物科技有限公司提供。LO2、HepG2、Hep3B、Huh-7及HCCLM3细胞由西安交通大学第一附属医院肝胆外科实验室保存。DMEM液体培养基及胎牛血清（Gibco）。RNA 提取试剂Trizol、转染试剂LipofectamineTM3000 及RT-PCR 试剂盒（Invitrogen）。SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒（BIO-RAD）。TRPC5、Akt、Ser473 磷酸化Akt、CCND1、MMP2 及GAPDH一抗（proteintech）。CCK-8试剂盒、流式细胞仪凋亡检测试剂盒（上海生工生物有限公司）。TRPC5引物（上游5'-GTTCTAGGTTTCATTTGGGGTGAGA-3'；下游5'-ACATTTCCCATTCCTCCCTTGG-3'）、GA PDH引物（上游5'-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3'；下游5'-GGACTCCACGACGTACTCA-3'）购自上海生工生物有限公司。Transwell小室（CORNING），人工基质胶（B&D）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 正常人永生化肝细胞LO2及肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7及HCCLM3细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度环境下进行培养传代。稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR 检 测miR-607 及TRPC5 mRNA 表 达使用Trizol试剂按操作指南提取临床标本组织或体外培养细胞中的总RNA。定量后，每份组织样品或细胞样品取等量RNA 配制20 μL 的逆转录反应体系合成cDNA。cDNA稀释10倍后取5 μL配制实时荧光定量PCR体系，按如下条件进行PCR反应：95 ℃预变性30 s，1循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40循环。以U6 RNA 为miR-607 内参，以GAPDH 为TRPC5 的内参，采用2-△△Ct法计算miR-607及TRPC5 mRNA的相对表达量。

1.2.3 miR-607 mimics细胞转染 HCC细胞以过夜培养达50%～70%之密度接种于6孔板中。miR-607 mimics转染分组：阴性对照组（miR-ctrl）加入100 pmoL/孔的阴性对照mimics及5 μL转染试剂，miR-607组（miR-607）加入100 pmoL/孔的miR-607 mimics及5 μL转染试剂；以无血清DMEM培养基调整终体积为2 mL/孔。按后续实验要求确认转染时间。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖 分别收集转染24、48 h及72 h 后的HCC细胞，制备密度为1×105/mL 的无血清DMEM基细胞悬液，以200 μL/孔接种于96孔板。加入10 μL/孔CCK-8 solution试剂后放置于细胞培养箱内避光培养2 h。于酶标仪上测定各孔450 nm的吸光度A450nm。每个样本独立重复实验3次。

1.2.5 流式细胞仪检测凋亡 取转染72 h后的HCC细胞，用1×Binding Buffer制备密度为1×106/mL的细胞悬液，每管加入500 μL细胞悬液、5 μLAnnexin Ⅴ-FITC和10μLPropidiumIodide。混匀后，室温下避光反应10min，进行流式细胞仪检测。每组样本独立重复实验3次。

1.2.6 划痕愈合实验检测细胞迁移 取转染24 h后的HCC细胞，以过夜培养达80%～90%之密度接种于6孔板中。过夜培养后用无菌200 μL移液器枪头沿培养孔中线划过制作初始划痕。以无血清DMEM培养基清洗培养孔以洗净悬浮细胞。每孔再次加入无血清DMEM培养基2 mL，将6孔板置于培养箱中继续培养48 h。在显微镜下拍照记录划痕剩余距离，计算细胞迁移情况。

1.2.7 Transwell 小室模型检测细胞侵袭 用无血清DMEM 培养基按1∶8 比例稀释50 mg/L 的基质胶100 μL/孔覆盖transwell小室上室面，于37 ℃细胞培养箱内风干1 h 制成侵袭小室模型。取转染48 h 后的HCC细胞用无血清DMEM培养基重悬，以2×105/mL的密度加入100 μL/孔的细胞悬液。24孔细胞培养板内加入750 μL/孔含10%胎牛血清的DMEM培养基，建立细胞侵袭检测模型。培养完成后，PBS清洗小室、4%多聚甲醛固定，并用0.1%的结晶紫染色10 min。擦除上室面未成功穿过小室膜的细胞，显微镜下观察并计数下室面细胞数目。

1.2.8 生物信息学分析 使用Targetscan 网站（https://www.targetscan.org/）确定miR-607 与潜在靶基因TRPC5 mRNA3'-UTR区的结合位点。

1.2.9 双荧光素酶报告基因系统 Huh-7及HCCLM3细胞分别以1×105/孔种于24孔板中过夜培养，每种细胞均 设置4 个分组Wt-TRPC5 质粒+miR-ctrl mimics；Mut-TRPC5 质粒+miR-ctrl mimics；Wt-TRPC5 质粒+miR-607 mimics；Mut-TRPC5质粒+miR-607 mimics。采用LipofectamineTM3000将混合物转染入特定细胞中培养48 h后，按双荧光素酶检测试剂说明书进行荧光强度测定。

1.2.10 Western blot 提取转染48 h后的HCC细胞总蛋白并调齐所有样品的蛋白浓度。采用垂直电泳法，利用4%～10%SDS-PAGE 凝胶按相对分子质量分离总蛋白。采用湿转法，按100 Ⅴ转印2 h之条件将分离后的蛋白转移至NC膜上，5%BSA室温封闭NC膜1 h。裁取目的蛋白所在的位置条带，按1∶1000 比例配制TRPC5、Akt、Ser473 磷酸化Akt、CCND1、MMP2 及GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。PBS洗去未结合一抗后采用1∶5000稀释的HRP标记山羊抗兔二抗室温孵育NC膜1 h。于暗室内，ECL法曝光目的蛋白，以条带灰度强度计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行分析，连续性资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验。非连续性资料结果采用Pearson卡方检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-607在肝细胞癌中表达及临床意义

分析45对HCC及癌旁组织的miR-607表达，HCC组织中miR-607 的平均表达水平低于对应癌旁组织（t=2.214，P=0.029，图1A）。以HCC组织中miR-607平均表达量为截断值，将45例肝细胞癌患者分为miR-607高表达组（n=16）和miR-607低表达组（n=29）。miR-607低表达与肿瘤直径＞5 cm（χ2=4.640，P=0.031）、血管侵犯（χ2=4.865，P=0.027）及较晚的TNM 分期（III+IⅤ，χ2=5.940，P=0.015）密切相关（表1）。在体外培养细胞中，与正常人永生化肝细胞LO2相比，所检测HCC细胞系中miR-607 的表达 水平均降低（HepG2：P=0.044，Hep3B：P=0.041，Huh-7：P=0.037，HCCLM3：P=0.031；图1B）。选择Huh-7及HCCLM3细胞进行mimics转染以开展下一步实验，结果显示，与miR-ctrl组相比，转染miR-607 mimics 提高了两种HCC 细胞内miR-607 的表达水平（Huh-7：P＜0.001，图1C；HCCLM3：P=0.003，图1D）。

表1 miR-607异常表达在肝细胞癌中的临床意义Tab.1 Correlation between miR-607 expression and clinicopathological features of HCC patients

图1 miR-607在HCC中的表达以及在Huh-7和HCCLM3细胞中过表达miR-607Fig.1 Expression of miR-607 in HCC and overexpression of miR-607 in Huh-7 and HCCLM3 cells.A: Down-regulated expression of miR-607 in HCC tissues (*P＜0.05 vs tumor-adjacent tissues).B:miR-607 expression is lower in the 4 HCC cell lines(HepG2,Hep3B,Huh-7,and HCCLM3)than in LO2 cells(*P＜0.05 vs LO2).C,D:Transfection of miR-607 mimics increases miR-607 expression in Huh-7(C)and HCCLM3(D)cells(*P＜0.05 vs miR-ctrl group).

2.2 过表达miR-607抑制HCC细胞增殖并诱导凋亡

与miR-ctrl组相比，miR-607组Huh-7细胞的增殖活力在转染48 h 后明显下降（P=0.037），并且在转染72 h后仍可检测出差异（P=0.023，图2A）。同时，转染72 h后通过流式细胞仪分析发现，miR-607组细胞凋亡比例高于转染miR-ctrl 组（P=0.005，图2B）。过表达miR-607可抑制HCCLM3的增殖活力（48 h：P=0.045，72 h：P=0.025；图2C）并促进细胞凋亡发生（P=0.004，图2D）。

图2 过表达miR-607抑制HCC细胞增殖并促进凋亡Fig.2 Overexpression of miR-607 inhibits proliferation and promotes apoptosis in HCC cells.A,C:Overexpression of miR-607 inhibits proliferation of Huh-7(A)and HCCLM3(C)cells.B,D:Overexpression of miR-607 promotes apoptosis of Huh-7(B)and HCCLM3(D)cells.*P＜0.05 vs miR-ctrl group.

2.3 过表达miR-607抑制HCC细胞迁移和侵袭

细胞划痕愈合试验发现，与miR-ctrl组相较，miR-607组中Huh-7细胞的迁移距离缩短（P=0.011，图3A）。Transwell侵袭小室结果显示，miR-ctrl组Huh-7细胞穿膜数量少于miR-607组Huh-7细胞穿膜数量（P=0.005，图3B）。过表达miR-607具有抑制HCCLM3细胞迁移（P=0.023，图3C）和侵袭（P=0.003，图3D）的效应。

图3 过表达miR-607抑制HCC细胞迁移和侵袭Fig.3 Overexpression of miR-607 inhibits migration and invasion of HCC cells.A,C:Overexpression of miR-607 inhibits migration of Huh-7(A)and HCCLM3(C)cells.B,D:Overexpression of miR-607 inhibits invasion of Huh-7(B)and HCCLM3(D)cells.*P＜0.05 vs miR-ctrl group.

2.4 miR-607靶向TRPC5抑制Akt通路激活

在Starbase、miRDB、TargetScan 数据库进行生物信息学检索发现，经典瞬时受体电位通道5（TRPC5）可能是miR-607的潜在靶点之一（图4A）。采用双荧光素酶报告基因系统检测证实，miR-607能够与HCC细胞内TRPC5 mRNA的野生型3'-UTR区直接结合（Huh-7：P=0.004，HCCLM3：P=0.011；图4B）。PCR及Western blot 检测显示，过表达miR-607 下调HCC 细胞内TRPC5 mRNA（Huh-7：P＜0.001，HCCLM3：P=0.002；图4C）及蛋白质（Huh-7：P=0.001，HCCLM3：P=0.013；图4D）的表达水平。

与miR-ctrl组相比，过表达miR-607的HCC细胞内Akt的磷酸化水平下调（Huh-7：P=0.034，HCCLM3：P=0.041）；同时，增殖相关分子CCND1（Huh-7：P=0.026，HCCLM3：P=0.029）及侵袭相关分子MMP2（Huh-7：P=0.004，HCCLM3：P=0.001）的表达水平降低（图4D、E）。

图4 miR-607靶向TRPC5抑制Akt通路激活Fig.4 miR-607 inhibits Akt pathway activation through targeting TRPC5.A:miR-607 was predicted to bind to TRPC5 mRNA3'-UTR region by bioinformatics analysis.B:Overexpression of miR-607 inhibits luciferase activity of wild-type(Wt)but not mutant-type(Mut)3'-UTR vectors of TRPC5 in HCC cells.C:Overexpression of miR-607 decreases TRPC5 mRNA expression in HCC cells.D,E:Total expressions of TRPC5,CCND1,MMP2 and phosphorylated Akt are decreased in Huh7(D)and HCCLM3(E)cells.*P＜0.05 vs miR-ctrl group.

3 讨论

MicroRNA异常表达与肿瘤生长转移［11,12］和患者预后［13］密切相关，其中miR-607在非小细胞肺癌中表达下调并提示预后不良［14］；慢性淋巴细胞白血病中miR-607通过下调WNT信号通路受体FZD3表达发挥细胞周期阻滞和凋亡诱导作用［15］。本研究发现，miR-607在HCC组织中的表达水平显著下调，miR-607低表达与肿瘤体积增大、血管侵犯和较晚的临床分期等肿瘤生长转移特征密切相关；体外实验表明miR-607 可以显著抑制HCC 细胞的增殖、迁移、侵袭，并诱导细胞凋亡的发生。肿瘤中MicroRNA的表达下调大多与长链非编码RNA、环状RNA等其他内源性RNA的分子海绵的吸附效应有关［16］。宫颈癌中miR-607被lncRNATP73-AS1吸附降解，导致其对下游靶点CCND2的抑制作用减弱，引起肿瘤发生凋亡抵抗和侵袭转移［17］。在HCC中发现lncRNATP73-AS1表达显著升高［18］，并促进HCC增殖侵袭［19］和放疗抵抗［20］，上述结果从侧面揭示了本研究所发现的miR-607低表达原因。

TRPC5是一种以同源四聚体形式锚定于细胞膜上的Ca2+离子通道［21］，开放后可介导细胞Ca2+内流［22］。据报道，TRPC5作为促癌因子在肺癌［23］、胃癌［24］中表达升高并与肿瘤生长转移和患者不良预后相关。生物信息学分析推断TRPC5可能是miR-607的潜在靶点之一。我们的研究通过双荧光素酶报告基因证实miR-607可 与TRPC5 的mRNA 3'-UTR 区直接结合，PCR 及Western blot结果也表明miR-607能下调TRPC5表达，说明TRPC5是miR-607的靶基因之一。

在肺鳞癌中，miR-607通过下调钙激活核苷酸酶1表达抑制肺癌细胞增殖侵袭［25］，提示Ca2+信号参与了miR-607的抑癌过程。研究证实，Ca2+信号异常活动是TRPC5发挥促癌作用的主要机制。结肠癌中TRPC5介导的Ca2+内流可激活HIF-1α/Twist轴促进上皮间质转化发生［26］。乳腺癌细胞中TRPC5的通过Ca2+依赖转录因子NFATC3诱导多药耐药蛋白1表达将细胞内阿霉素泵至胞外，诱导原发性耐药形成［27］。在HCC中，通道受体异常表达引起的Ca2+内流能激活PI3K/Akt通路来促进HCC生长和转移［28］。据此线索，本研究发现过表达miR-607 能够削弱Akt 的磷酸化并下调CCND1、MMP2等Akt通路下游效应分子的表达，初步揭示了miR-607抗肿瘤的潜在生物学机制。由于目前尚未能在裸鼠荷瘤模型中进一步验证miR-607的抗癌活性及体内作用机制，因此尽管本研究在体外分子过程方面进行了较为深入的探索，但其结果仍有一定的局限性，需要在未来的工作中进一步完善。

综上所述，HCC中低表达miR-607与肿瘤恶性临床特征密切相关。MiR-607通过下调TRPC5表达进而抑制Akt通路激活来发挥抗HCC生长转移作用。调控miR-607表达具有靶向治疗肝细胞癌潜力。