赵爱月，苏云霞，傅德强

福建医科大学附属第二医院肿瘤内科，福建 泉州 362000

近年来，以PD-L1/PD-1通路阻断为代表的肿瘤免疫治疗在多个肿瘤疾病取得突破性进展［1-4］。但肿瘤免疫治疗在卵巢癌领域尚未有重大进展。研究表明，化疗能够促进卵巢癌［5］和其他肿瘤患者［6-8］肿瘤组织PD-L1表达显著上调。肿瘤组织PD-L1高表达提示肿瘤免疫微环境有利于抗PD-L1/PD-1治疗［9,10］。因此，深入探讨影响肿瘤免疫微环境形成的因素和机制具有重要意义。肿瘤免疫微环境受到诸多因素影响［11,12］，包括肿瘤局部免疫细胞浸润程度、胞内信号通路传导和微小RNA（microRNA，miRNA）调控作用等。miRNA通过结合mRNA的3'端非编码区（3'-UTR），抑制mRNA翻译过程，介导靶基因表达调控作用。证据显示，miRNA通过调控卵巢癌肿瘤组织PD-L1表达改变肿瘤免疫微环境格局。研究发现，下调肿瘤相关性巨噬细胞源性外泌体miR-29a-3p表达，能够通过FOXO3-AKT/GSK3β信号通路抑制PD-L1表达，进一步抑制卵巢癌进展［1-3］。有研究在SKOⅤ3 人卵巢癌细胞株实验中发现，上调miR-654 能够通过EMX2OS/miR-654/AKT3 轴促进PD-L1表达，并增强卵巢癌细胞的侵袭性［14］。然而，大多数研究均聚焦于miRNA与PD-L1之间的关系，与其他免疫相关基因的相互关系鲜有报道。本研究基于癌症基因组图谱（TCGA）和高通量基因表达（GEO）数据库，采用生物信息学方法探讨卵巢癌肿瘤组织PD-L1表达的最佳阈值，进一步通过基因表达差异分析，筛选对卵巢癌肿瘤免疫微环境具有重要作用的miR-4772和核心基因，并深入探讨miR-4772与核心基因的关系以及潜在机制，为卵巢癌肿瘤免疫治疗寻找新的生物标记物和治疗靶点。

1 资料和方法

1.1 卵巢癌患者肿瘤组织芯片数据来源

本研究中卵巢癌患者肿瘤组织基因芯片数据来源于TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库。所有数据均进行归一化和去除批间差处理，在纳入研究的卵巢癌患者，294名患者数据来源于TCGA数据库并作为训练集，399名患者数据来源于GEO数据库并作为验证集，包括GSE30161、GSE32062、GSE63885和GSE119056。

1.2 生物信息分析

采用“survival”、“survminer”R包进行生存分析和PD-L1 表达水平最佳阈值的确定；通过“limma”、“ggplot2”、“Rtsne”R包筛选差异基因分析和进行主成分分析；运用“WGCNA”R包进行权重基因共表达网络分析（WGCNA）；利用Cytoscape中的“Hub”计算筛选核心基因；通过“GSⅤA”、“GSEABase”R包进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)；利用“org.Hs.eg.db”、“clusterProfiler”和“enrichplot”R包对DEG进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。利用STRING工具构建蛋白质相互作用（PPI）网络，寻找蛋白质之间的相互作用关系。

1.3 SKOⅤ3人卵巢癌细胞转染miR-4772模拟物和抑制物及基因测序

SKOⅤ3 人卵巢癌细胞铺种于24 孔板，37 ℃、5%CO2培养箱孵育至30%细胞汇合度，opti-MEM稀释后miR-4772-3p模拟物、抑制物、相应阴性对照物以及未处理对照，分别与Lipofectamine-2000 试剂（Life Technologies）混匀后加入无血清McCoy's 5A细胞培养液转染6 h，更换含10%胎牛血清的McCoy's 5A细胞培养液继续培养48 h，收集细胞并提取总RNA，合成双链cDNA，纯化扩增产物后进行文库构建，包括DNA片段化处理、末端修复、加“A”加接头以及PCR 扩增和文库质控，采用Illumina 平台进行基因表达谱测序，根据FPKM算法计算基因表达量。

1.4 统计学处理

应用R4.0.2软件进行统计分析，使用limma数据包中的Studentt检验方法筛选DEG。KEGG中选择差异有统计学意义（P＜0.05）的信号转导通路进行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比较采用logrank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。连续变量的比较采用t检验，分类变量通过χ2检验分析（n＜5时行连续校正χ2检验）。

2 结果

2.1 卵巢癌PD-L1表达水平最佳阈值的确定

基于患者生存时间和生存状态，生存分析结果显示，肿瘤组织PD-L1表达阈值为0.59562，即PD-L1表达水平的60%分位数（图1A）；PD-L1高表达组较PD-L1低表达组具有显著生存优势（P=0.004），两组疗效差异无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析结果显示，患者疗效与生存时间存在高度相关性，其趋势与生存状态-生存时间曲线高度吻合（图1B）。疗效取代生存状态作为自变量，生存分析结果显示，肿瘤组织PD-L1最佳表达阈值为1.3158，即PD-L1 表达水平的90%分位数；与PD-L1 低表达组相比较，PD-L1 高表达组在生存（P=0.018）和疗效（P=0.006）方面均具有显著优势（图1C）。GEO验证集生存分析结果显示，基于PD-L1表达水平90%分位数分组，PD-L1高表达组在生存方面优于PDL1低表达组（P=0.019，图1D）。因此，本研究采用PDL1表达水平90%分位数作为分组阈值。

图1 卵巢癌肿瘤组织PD-L1表达最佳阈值与生存的关系Fig.1 Survival outcomes of ovarian cancer patients stratified by the optimal cutoff level of PD-L1 expression.A:Survival curves of the patients with low and high PD-L1 expression in TCGA cohort.B:Correlation of OS with survival status and therapy outcome.C: Survival curve according the optimal cutoff point of PD-L1 expression based on OS and therapy outcome.D:Survival curve of GEO cohort according the acquired cutoff point of PD-L1 expression.

2.2 重要差异表达基因的筛选

差异基因分析结果显示，TCGA数据集筛选出840个差异表达基因，其中549个基因显著上调，291个基因显著下调（图2A）。差异表达基因相关性分析结果显示，miR-4772与PD-L1表达高度相关，20个重要差异基因与miR-4772、PD-L1表达均密切相关（P＜0.001，|log FC|≥0.5，degree＞100，图2B）。PD-L1表达相关性分析显示，miR-4772与PD-L1表达呈现高度相关性，20个重要差异表达基因与miR-4772表达密切相关（图2C）。

图2 差异表达基因分析和PD-L1相关miRNA筛选Fig.2 Identification of DEGs and PD-L1-related miRNAs.A:Significantly upregulated(red)and downregulated(green)DEGs(|logFC|＞0.5,P＜0.05).B:Distribution of the important DEGs(P＜10-8,|log FC|≥0.5,degree＞100).C:Selection of miR-4772-related important DEGs.

2.3 权重基因共表达网络分析和核心基因筛选

差异表达基因进行权重基因共表达网络分析，结果显示，蓝色模块基因与PD-L1表达密切相关（cor=0.78，P＜0.001，图3A～C）。连接度前100 基因分析显示，miR-4772与PD-L1表达呈现高度相关性，48个权重基因与miR-4772表达密切相关（图3D）。交集分析显示，12个核心基因共同存在于20个重要差异基因与48个权重基因，包括PTPN22、FASLG、TRAF3IP3、CD247、CD96、CCR5、LCP2、IL21R、ITGAL、TBX21、SLA2 和GRAP2（图3E）。

图3 WGCNA分析和核心基因筛选Fig.3 WGCNA analysis and identification of the hub genes.A:Hierarchical clustering dendrogram of ovarian cancer samples.B: Relationship between different modules and PD-L1 expression.C: Scatter plot of gene significance and module membership in the blue module.D:Connectivity of PD-L1-related miRNAs based on WGCNAanalysis.E:Intersection between the weighted genes and the important DEGs.

2.4 PD-L1和miR-4772表达水平对卵巢癌患者肿瘤组织免疫格局的影响

ssGSEA分析结果显示，PD-L1高表达组肿瘤组织免疫浸润和功能活性均高于低表达组，与患者生存状态和疗效展现密切相关性（图4A）；miR-4772高表达组肿瘤组织免疫浸润和功能活性高于低表达组，与PD-L1表达水平密切相关（图4B）。GEO验证集分析结果显示，与PD-L1低表达组相比，PD-L1高表达组肿瘤微环境具有更高的免疫活力（图4C）；miR-4772高表达组较低表达组展现出较强的免疫活力趋势（图4D）。

图4 分别基于PD-L1和miR-4772分组对卵巢癌肿瘤微环境的影响Fig.4 Tumor immune microenvironment profile in different groups divided by the expression of PD-L1 or miR-4772.A: Unsupervised clustering heat map showing the association between immune infiltration and PD-L1 expression in TCGA cohort.B: Unsupervised clustering heat map showing the association between immune infiltration and miR-4772 expression in TCGA cohort.C:Unsupervised clustering heat map showing the association between immune infiltration and PD-L1 expression in GEO cohort.D:Unsupervised clustering heat map showing the association between immune infiltration and miR-4772 expression in GSE119056 cohort.

2.5 核心基因KEGG功能分析和PPI网络分析

KEGG功能分析结果显示，12个核心基因主要涉及NK细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体信号通路、Th17细胞分化、细胞因子-受体相互作用、Th1和Th2细胞分化等（图5A）。PPI分析结果显示，12个核心基因存在密切相互作用，与PD-L1表达存在直接或间接作用，CD247在PPI网络中显示出重要作用（图5B）。

图5 核心基因KEGG和PPI分析Fig.5 KEGG analysis and PPI analysis of the hub genes.A:KEGG analysis of the hub genes;B:PPI analysis of the hub genes.

2.6 核心基因与卵巢癌患者预后相关性分析

生存分析结果显示，CD96和TBX21表达水平均与卵巢癌患者生存预后密切相关，高表达组优于低表达组（P=0.024，0.001）；其余10个核心基因表达水平未表现明显生存预后相关性（图6）。

图6 核心基因与卵巢癌患者生存预后关系Fig.6 Correlation of the expressions of the hub genes with the survival of ovarian cancer patients.A:Survival analysis in high-and low-expression groups stratified according to the median of CD96 expression.B:Survival analysis in high-and low-expression groups stratified according to the median of TBX21 expression.

2.7 SKOⅤ3 卵巢癌细胞株转染miR-4772 mimic 和inhibitor后核心基因表达分析

SKOⅤ3卵巢癌细胞株转染miR-4772模拟物和抑制物后，与未转染组相比，模拟物组PD-L1和核心基因表达均有不同程度上调，抑制物组表现出不同程度下调（P＜0.05）；其中，PD-L1、PTPN22、FASLG、TRAF3IP3、CD247、CD96、CCR5、LCP2、TBX21、SLA2、GRAP2基因表达与未处理组的差异均具有统计学意义（P＜0.05），IL21R、ITGAL基因表达相比未处理组差异无统计学意义（P＞0.05，图7）。

图7 SKOⅤ3细胞转染miR-4772模拟物和抑制物后核心基因表达Fig.7 Expression of the hub genes in SKOV3 cells transfected with the mimic and inhibitor of miR-4772.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs all groups.

3 讨论

近年来，以PD-L1/PD-1通路阻断为代表的肿瘤免疫治疗在多个恶性肿瘤疾病已经取得巨大成功，然而肿瘤免疫治疗在卵巢癌领域尚未有重大突破。研究表明，miRNA能够调控卵巢癌肿瘤组织PD-L1表达并改变肿瘤免疫微环境［15,17］。研究发现，miR-145通过靶向c-Myc转录因子，介导PD-L1表达上调，进一步诱导T细胞发生凋亡，产生肿瘤免疫耐受［15］。miR-576-3p过表达导致卵巢癌细胞株PD-L1和cyclin D1表达下调，从而提高卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性［16］。miR-4772表达下调与胰腺癌早期发病密切相关［17］。miR-4772具有抑制胰腺癌进展的作用，可作为胰腺癌的预后因子［18］。因此，我们推测，miR-4772与恶性肿瘤的发生、发展具有密切联系。

在多数临床前和临床研究，衡量PD-L1表达水平主要采用PD-L1 mRNA表达中位值、免疫组化染色评分、联合阳性分数（CPS评分）和肿瘤细胞阳性比例分数（TPS评分）。临床实践结果表明，以上指标均未能精准反映抗PD-L1/PD-1治疗疗效。本研究通过生物信息学方法获得卵巢癌患者肿瘤组织PD-L1表达的最佳阈值，即90%分位数。进一步分析表明，以PD-L1表达水平90%分位数作为阈值能够精准地预测卵巢癌患者的生存和疗效。通过基因表达相关性分析发现，miR-4772表达与PD-L1表达呈正相关，并且与卵巢癌患者肿瘤免疫微环境密切相关，miR-4772高表达预示肿瘤免疫应答能力显著增强，可能有利于肿瘤免疫治疗。

核心基因是生物学过程中发挥至关重要作用的基因，促进或抑制其他相关基因表达［20］。本研究共筛选12个与miR-4772 密切相关的核心基因，包括PTPN22、FASLG、TRAF3IP3、CD247、CD96、CCR5、LCP2、IL21R、ITGAL、TBX21、SLA2和GRAP2。KEGG分析结果表明，12个核心基因主要涉及免疫相关信号通路。PTPN22 是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)超家族的成员之一，可下调T细胞信号转导和抑制增殖，并且被认为是一种系统可药物化的新型免疫治疗靶点［21］。FASLG是一种II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，在调节免疫系统和癌症进展中发挥着重要作用［22］。TRAF3IP3在免疫系统中表达，参与细胞成熟、组织发育和免疫应答［23］。CCR5主要作为趋化因子受体参与免疫应答过程［24］。LCP2是一种信号转导接头蛋白，介导T细胞受体信号转导过程［25］。IL21R属于I型细胞因子受体，主要介导T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞的增殖和分化［26］。ITGAL是整合素家族的一员，其异常表达与癌变和免疫调节有关［27］。SLA2属于SLAP家族接头蛋白，可能介导下调T细胞和B细胞介导的反应和抑制抗原受体诱导的钙动员［28］。GRAP2基因主导白细胞特异性蛋白酪氨酸激酶信号转导，并促进T细胞免疫应答［29］。CD247在抗原识别与细胞内信号转导途径的耦合过程发挥重要作用［30］。CD96通过共抑制受体作用介导T细胞和NK细胞免疫应答［31］。TBX21能够介导调节Th1细胞因子和干扰素γ（IFN-γ），其表达水平与肿瘤患者预后密切相关［32］。本研究PPI分析显示，12个核心基因和PD-L1基因之间存在紧密联系，CD247在miR-4772介导的肿瘤免疫相关过程中，可能扮演着重要的作用。12 个核心基因生存分析结果表明，CD96 和TBX21 与卵巢癌患者生存密切相关。本研究通过SKOⅤ3卵巢癌细胞株转染miR-4772模拟物和抑制物，结果提示随着miR-4772表达发生改变，PD-L1和大部分核心基因表达也发生相应变化，进一步支持miR-4772通过直接或间接影响核心基因与PD-L1表达水平，调控卵巢癌肿瘤免疫微环境的格局。但是，本研究中ITGAL和IL21R表达未见明显改变，考虑是实验个体差异所致。

基于以上结果，本研究认为miR-4772可能通过直接或间接调节12个核心基因表达，促进卵巢癌患者肿瘤免疫微环境发生改变，并诱发PD-L1表达发生相应变化。其中，CD96和TBX21在肿瘤免疫微环境形成过程中可能扮演着重要作用。本课题为卵巢癌肿瘤免疫微环境提供新的研究思路，然而尚未确定miR-4772直接相互作用基因，这将作为下一步深入研究的方向。