胡启良，杨滨娟，刘宁，黄国勤

江西农业大学生态科学研究中心，南昌 330045

我国农业生产每年大约使用0.3 亿t 氮肥，约占全球农业氮肥使用量的30%[1］。有研究表明，我国的氮肥利用率仅有30%[2］，远低于西方发达国家。过量施用氮肥，不仅导致大量氮素盈余和地下硝酸盐污染[3］，破坏了农田生态环境，而且会降低作物产量和农产品品质[4］，目前我国农业生产特别是在水稻生产中普遍存在过量施用氮肥和氮肥利用率偏低的状况，严重影响了稻田生态系统的稳定性和可持续性[5］，不利于农业的可持续发展。因此，如何提高氮肥利用效率，缓解稻田农业环境压力，维持土壤健康，是当前农业研究的重要方向。

绿肥作为有机物还田为土壤增加丰富的养分、促进土壤中难溶性养分转化、改善土壤理化性状、增加土壤微生物活动以及有利于水土保持[6］。紫云英与油菜混播，充分利用光、温、水资源和生态位差，较单播绿肥养分供给、提高水稻产量和培肥土壤效果更好。黄建余等[7］研究表明，紫云英与油菜混播的鲜草还田总量较紫云英单播处理高出了7 395~9 795 kg/hm2。张秋丽等[8］研究表明，紫云英与油菜以合适的比例混播可显著提升后茬水稻产量。绿肥间作能显著提高土壤养分利用效率和土壤微生物量，影响微生物活性和群落结构[9-10］。有研究表明在保证水稻稳产的前提下，紫云英能够代替20%~40%的化肥[7］。夏文建等[11］研究表明，绿肥还田能够有效增加表层土壤的有机碳和可溶性有机碳的含量，有研究表明，绿肥还田能增加土壤总有机碳、轻组有机碳和可溶性有机碳的含量[12-13］，张迪等[14］研究结果表明，增施有机肥可以显著增加水稻土可溶性有机碳、微生物量碳以及易氧化有机碳含量；肖小平等[15］研究表明稻草还田下短期内的减氮不会显著降低土壤的全氮含量，但会显著降低土壤的碱解氮含量。土壤C/N 变化会影响土壤微生物量和有机肥中的元素固定与释放，进而影响土壤肥力和土壤碳氮循环[16-17］。佀国涵等[18］研究表明，长期种植绿肥能够提高农田土壤中细菌、真菌和放线菌的丰度以及土壤微生物量碳的含量。不同的施肥措施不仅影响着土壤的理化性质，也影响着微生物生长发育所需要的养分、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等；绿肥翻压还田与减施氮肥改变能够改变土壤“碳”源和“氮”源[20］，从影响土壤微生物群落结构。

目前关于绿肥还田与减施氮肥的研究，大多关注后茬作物产量和土壤养分，而关于土壤碳氮和微生物群落结构的研究较少。本研究探讨在绿肥混播还田下，减施氮肥对土壤活性有机碳组分和氮组分的影响及微生物多样性和群落结构的变化，旨在为提升稻田产量、土壤肥力和维持生态系统平衡提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020 年9 月−2021 年11 月，在江西农业大学科技园水稻试验田（28°46′N，115°55′E）进行。试验地属于亚热带季风性湿润气候，年均太阳总辐射量为4.79×1013J/hm2，年均日照时数为1 852 h，年均日温≥0 ℃的有效积温达6 450 ℃，年降水量1 665.7 mm，年平均气温17.1~17.8 ℃。供试验土壤为发育于第四纪的红黏土，为亚热带典型红壤分布区。试验开始时有机质含量（34.93±0.41）g/kg，全氮含量（2.00±0.02）g/kg，有效磷含量（15.58±1.41）mg/kg，速效钾含量（41.73±1.08）mg/kg，pH值4.98±0.02。

1.2 供试材料

供试作物与品种：紫云英（余江大叶籽）、油菜（中油5号）、早稻（中嘉早17）、晚稻（天优华占）。

1.3 试验设计

在冬季种植紫云英18.75 kg/hm2+油菜3.75 kg/hm2的条件下，设置0、150、120、90和60 kg/hm25 个施氮水平（CK、MRN、MRN1、MRN2、MRN3）共5 个处理，3个重复，15个小区，每小区面积为16.5 m2（5.5 m×3 m），小区间用高30 cm 的水泥埂隔开，试验前各小区土壤肥力均匀一致，每小区施肥量见表1，两边设有保护行，保护行宽度为30 cm。

表1 紫云英油菜混播与减氮试验设计Table 1 Experimental design of mixed sowing of Chinese milk vetch and rapeseed and reduced application of nitrogen fertilizer kg/hm2

紫云英于2020年9月29日撒播，不施肥；油菜于2020 年11 月11 日撒播，不施肥。早稻于2021 年3 月25 日播种，5 月3 日移栽，7 月21 日收获；晚稻于6 月27日播种，7月28日移栽，10月24日收获。化肥种类及其用量参照当地常规施肥：氮肥（N）150 kg/hm2，钾肥（K2O）120 kg/hm2，磷肥（P2O5）90 kg/hm2。氮肥（N 46%）按基肥∶分蘖肥∶穗肥=3∶4∶3，钾肥（K2O 60%）按分蘖肥∶穗肥=7∶3 施入，钙镁磷肥（P2O512%）全部做基肥施入。

1.4 样品采集与测定

1）水稻测产及考种。于早晚稻成熟期，各小区普查20 蔸作为有效穗计算的依据，用平均法在各小区随机选取有代表性的水稻植株5蔸，风干后作为考种材料。用清水漂洗，去空秕粒晾干后，用1/100 分析天平测千粒重（干质量）；每小区单打实收作为实际产量。水稻考种项目包括有效穗数、结实率、每穗粒数、千粒重。

2）土壤活性有机碳测定。于晚稻收获后，每小区按5 点法取土样，取0~15 cm 的耕作层土壤，混合均匀，一部分土壤自然风干，除去杂质过筛，存放于4 ℃冰箱用于活性有机碳的测定。土壤总有机碳测定采用重铬酸钾外加热法；活性有机碳采用333 mmol/L 高锰酸钾氧化法测定；可溶性有机碳采用水提取、过滤方法测定；微生物量碳采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法测定；易氧化有机碳采用333 mmol/L高锰酸钾氧化-比色法测定。

3）土壤微生物测定。于晚稻收获后，在每小区进行随机5点取作物根际土样，混匀后立即用液氮冷冻并有−80 ℃冰箱保存，委托美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。首先采用美国QIAGEN公司的DNeasy®PowerSoil®Pro Kit 试剂盒提取土壤样品中的微生物DNA，然后用超微量分光光度计测定DNA 浓度和纯度，采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性。使用引物338F：ACTCCTAC⁃GGGAGGCAGCAG 和 引 物806R：GGACTACH⁃VGGGTWTCTAAT 对微 生 物 的16S rRNA 进行PCR 扩增。使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。对PCR产物鉴定、纯化及定量，构建Miseq文库，最后利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

1.5 数据处理

Miseq 测序得到的PE reads 首先根据overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类分析和物种分类学分析；基于OTU 聚类分析结果，计算真菌、细菌群落丰度指数、均匀度指数、多样性指数、覆盖度指数，利用美吉云平台对微生物群落进行Alpha 多样性分析、物种组成分析、样本比较和环境因子关联分析。

采用Microsoft Excel 2019 进行数据统计；用SPSS 25.0 系统软件进行数据处理和方差分析，采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan’s 法进行方差分析和多重比较，用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 减氮对水稻产量的影响

如表2所示，紫云英与油菜混播下不同减氮水平对水稻产量和产量构成要素有一定影响。各处理的实际产量均与不施肥处理（CK）差异显著（P<0.05），与对照相比，早稻增产24.42%~39.23%，晚稻增产19.34%~31.59%，早稻和晚稻均是处理MRN1 增产效果最好，且晚稻除MRN2 外，与其他处理间均差异显著（P<0.05）。另外，从各产量构成要素来看，早晚稻减氮均以处理MRN1 有效穗数最多，早稻处理MRN、MRN1、MRN2 的有效穗数显著高出CK 8.41%~23.93%（P<0.05），晚稻各处理均显著高于CK（P<0.05），高出16.91%~27.73%。从千粒重来看，早稻处理MRN3 显著高于CK（P<0.05），高出5.00%；晚稻时期各处理均显著高出CK 1.62%~2.54%（P<0.05）。但早晚稻各处理的每穗粒数和结实率均差异不显著（P>0.05）。整体上，与常规施氮处理相比，减氮20%处理不会降低水稻产量反而会增产。

表2 不同施氮量对水稻产量和构成要素的影响Table 2 Effects of different nitrogen application rates on rice yield and components

2.2 减氮对土壤活性有机碳及组分的影响

在紫云英与油菜混播还田的条件下，不同减氮量对晚稻成熟期土壤活性有机碳组分的影响如表3所示。处理MRN1 的土壤有机碳含量最高，高出处理CK 17.53%。处理MRN2 的微生物量碳含量最高，高出CK 16.05%。处理MRN1 的活性有机碳含量最高，高出处理CK 8.53%。土壤可溶性有机碳和易氧化有机碳含量均是CK 最高，且呈现出随施氮减少而增加的规律。

表3 不同施氮量下土壤活性有机碳及组分含量Table 3 Soil active organic carbon and its components under different nitrogen application rates

2.3 减氮对土壤氮素的影响

在紫云英与油菜混播还田的条件下，不同施氮量对晚稻成熟期土壤氮组分的影响如表4 所示。各施氮肥处理的全氮含量均显著高于CK，高出13.75%~22.31%。处理MRN 和处理MRN1 的硝态氮含量显著高于处理CK，高出了22.07%~22.84%。处理MRN1 的铵态氮含量显著高于CK，高出19.05%。处理MRN 和处理MRN1 的碱解氮含量显著高于处理CK，高出11.20%~11.39%。土壤硝态氮和碱解氮含量随施氮量的减少而降低。

表4 不同施氮量下土壤氮组分含量Table 4 Soil active nitrogen components under different nitrogen application rates

2.4 土壤碳氮相关性分析

不同施氮水平下土壤碳库和氮库的相关性如表5 所示。各项碳库指标间，土壤可溶性有机碳、活性有机碳和易氧化有机碳三者互相呈显著正相关（P<0.05）。各土壤氮库指标间，土壤全氮、碱解氮、硝态氮和铵态氮四者互相呈显著正相关（P<0.05）。有机碳含量与其余碳指标呈负相关（P>0.05），与碱解氮、硝态氮、铵态氮呈显著正相关（P<0.05）。微生物量碳与其余碳指标呈正相关，与全氮、碱解氮、硝态氮呈显著负相关（P<0.05），与铵态氮也是负相关。微生物量氮与活性有机碳指标呈正相关（P>0.05），但与有机碳呈显著负相关（P<0.05）；与碱解氮、铵态氮呈显著负相关（P<0.05）。

表5 不同施氮量下土壤碳和氮的相关性分析Table 5 Correlation analysis of soil carbon and nitrogen under different nitrogen application rates

2.5 土壤样品的注释评估

从微生物群落的Pan/Core OTU 分析曲线（图1）可以看出，每个处理土壤微生物的Pan Core OTU 数由2 个样本增加到3 个样本时，曲线接近平缓，继续增加处理重复数量，微生物的Pan Core OTU 数不会有大的变化。细菌群落Pan OTU 数的表现顺序为MRN1>CK>MRN2>MRN3>MRN，细菌群落Core OTU 数的表现顺序为MRN2>CK>MRN3>MRN1>MRN。

图1 不同施氮量下土壤细菌群落Pan/Core OTU 分析Fig.1 Pan/Core OTU analysis of soil bacterial community under different nitrogen application rates

通过高通量测序共获得优化序列843 800 条，351 572 912 bases，平均长度416 bp。物种注释共获得门水平物种59 个，属水平物种947 个，OTU 水平7 622 个。在晚稻成熟期的土壤样品中，处理MRN含OTUs 5 693 个，其中特有的OTUs 111 个；处理MRN 含OTUs 5 693 个，其中特有的OTUs 111 个；处理MRN1 含OTUs 6 183 个，其中特有的OTUs 173 个；处理MRN2 含OTUs 5 945 个，其中特有的OTUs 67 个；处理MRN3 含OTUs 5 844 个，其中特有的OTUs 36个；处理CK含OTUs 6 006个，其中特有的OTUs 69 个（图2）。处理MRN1 的总OTUs 数和独有OTUs数都是最高的。

图2 不同施氮量下土壤细菌群落OTUs分布的Venn图Fig.2 Venn diagram of OTUs distribution of soil bacterial community under different nitrogen application rates

2.6 减氮对土壤微生物群落多样性的影响

不同施氮处理土壤细菌群落Alpha 多样性指数分析（表6）结果显示，处理MRN 的Simpson even 指数显著高于CK，高出28.57%，减施氮肥降低了细菌群落的均匀度指数。处理MRN2 的Sobs 指数最高，处理MRN 最低，适当减施可增加细菌群落丰富度。除处理MRN2 外，细菌多样性指数随施氮量的减少而降低。

表6 不同施氮量下细菌群落多样性指数Table 6 Diversity index of microbial community under different nitrogen application rates

2.7 土壤微生物物种组成分析

紫云英、油菜混播下不同施氮量处理土壤微生物群落在门水平的优势物种丰度如图3 所示。排名前5的优势细菌是绿弯菌门、变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门，其中绿弯菌门（Chloroflexi）在所研究的门类中占17.56%~18.92%，变形菌门（Pro⁃teobacteria）在所研究的门类中占14.33%~17.92%，酸杆菌门（Acidobacteriota）在所研究的门类中占14.29%~17.43%，放线菌门（Actinobacteriota）在所研究的门类中占9.31%~12.61%，厚壁菌门（Fir⁃micutes）在所研究的门类中占5.38%~7.70%，各处理间细菌数量占比无显著性差异（P>0.05）。

图3 不同施氮量下土壤细菌群落的优势物种丰度（门水平）Fig.3 Abundance diagram of dominant species of soil bacterial community under different nitrogen application rates（phylum level）

紫云英、油菜混播条件下不同施氮量细菌群落门水平与物种Circos 关系如图4 所示，在细菌群落中丰度排名前5 的门分类水平物种在CK、MRN、MRN1、MRN2、MRN3处理的占比，各处理中绿弯菌门（Chloroflexi）分 别 占20%、21%、20%、19%、20%，变形菌门（Proteobacteria）分别占21%、17%、19%、21%、22%，酸杆菌门（Acidobacteriota）分别占22%、20%、19%、18%、20%，放线菌门（Actinobac⁃teriota）分别占20%、16%、22%、22%、20%，厚壁菌门（Firmicutes）分 别 占19%、17%、19%、25%、21%。

图4 不同施氮量下样本与物种的Circos图Fig.4 Circos diagram of samples and species under different nitrogen application rates

2.8 土壤微生物群落与环境因子的关系

土壤细菌群落与碳氮组分的冗余分析（RDA）（图5）显示，土壤细菌群落32.43%的变异可被第一排序轴解释，23.12%的变异可被第二排序轴解释。排名前5的门水平优势菌群均在RDA1轴的负半轴，方向大致相同，说明土壤碳氮组分对优势细菌群落的影响是相同的。环境因子中，对细菌群落影响最大的是碱解氮、微生物量氮和可溶性有机碳，碱解氮、硝态氮、铵态氮与优势菌群呈负相关关系；微生物量氮、易氧化有机碳、可溶性有机碳与优势菌群呈正相关关系。酸杆菌门、绿弯菌门与土壤铵态氮、总有机碳、活性有机碳呈负相关，与土壤微生物量呈正相关。

图5 不同施氮量下的土壤细菌群落与碳氮的RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil bacterial community and carbon and nitrogen under different nitrogen application rates

3 讨 论

紫云英与油菜混播还田后，适当减施氮肥不会降低水稻产量；混播处理中，减氮20%的实际产量最高。减施氮肥降低了土壤全氮、硝态氮、铵态氮和碱解氮含量，增加了可溶性有机碳和易氧化有机碳含量。碱解氮、微生物量氮和可溶性有机碳是影响细菌群落的主要环境因子；施氮量会影响土壤微生物群落结构，减施氮肥会降低细菌群落均匀度指数，减施氮肥可增加优势菌门的相对丰度。

3.1 不同施氮量对水稻产量的影响

施用氮肥是提高作物产量的重要手段。紫云英、油菜混播可以充分利用光、热、水、养分、土地资源。王吕等[21］研究表明绿肥稻秆协同还田在减氮20%~30%的条件下可以保证水稻产量不下降且有所增加；郭晓彦等[22］的研究结果表明在绿肥翻压的条件下，减氮60%较减氮80%的增产效果好；张俊莹等[23］研究结果表明当减氮量超过10%时，随着氮肥量的减少水稻产量逐渐降低。黄晶等[24］通过长期定位试验证明了绿肥紫云英替代氮肥的可行性，试验表明减少化学氮肥用量20%~40%，不会降低稻谷产量。本研究结果表明紫云英油菜混播还田与减氮40%可保持水稻产量不下降，减氮20%可增加7.77%~8.79%的产量。因此，在冬种紫云英与油菜的高效绿肥还田模式下，适当减施氮肥不会降低水稻产量，反而有略微增产效果。

3.2 不同施氮量对土壤碳氮的影响

土壤有机碳累积量既与有机物料施用量、施用时间有关，更与当地气候和土壤条件有关[25］，后者会强烈影响有机物料的矿质化和腐殖化过程的强弱。李锦等[26］研究表明在秸秆还田的情况下，减氮15%、30%不会显著降低土壤有机碳和活性有机碳含量。石柯等[27］在小麦-玉米轮作试验中发现，减氮20%可以在一定程度上增加土壤有机碳含量。王兴龙等[28］研究表明，适当减少氮肥施用量的同时配施生物有机肥可提高土壤有机碳、活性有机碳和微生物量碳含量。本研究中紫云英与油菜混播还田后，减氮20%可增土壤有机碳和微生物量碳含量；可溶性有机碳与易氧化有机碳含量随施氮量的增加而减少。原因可能是减施氮肥增加了土壤C/N 比，提升了土壤微生物活性，促进绿肥腐解后形成的腐殖质的分解，使得土壤活性有机碳组分含量增加。

减氮施肥的目的是在保证产量的基础上提高氮素利用率，降低氮素损失。罗跃等[29］研究表明在减施10%~20% 常规量氮肥条件下，绿肥还田的土壤氮库贮量较常规量施氮肥处理有上升趋势，但差异未达到显著水平。肖小平等[15］研究表明稻草还田下短期内的减氮不会显著降低土壤的全氮含量，但会显著降低土壤的碱解氮含量。本研究结果表明在绿肥混播的条件下，较常规施氮和减氮20%处理相比，不施氮肥处理土壤全氮、硝态氮和碱解氮含量显著下降。朱荣等[30］研究表明与常规施肥相比，减施氮肥能显著降低稻田氨挥发损失总量。本研究中，除减氮20%处理外，其余处理均降低了土壤铵态氮含量。土壤全氮、碱解氮、硝态氮和铵态氮呈显著正相关关系，减施氮肥会降低土壤氮组分含量。

3.3 不同施氮量对微生物群落的影响

在土壤生态系统中，微生物是物质循环和能量流动的重要参与者、维持者和贡献者，承担了碳氮循环等多种重要的生态服务功能。翻压绿肥可为微生物生长繁殖提供充足的碳源及氮源，影响微生物对碳源的利用，从而改变微生物群落的结构及多样性，施肥改变土壤组成和水稻根际环境，从而直接或间接地改变稻田土壤微生物群落结构[31］。万水霞等[32］发现施用紫云英绿肥可显著提升土壤细菌丰度。Wang 等[33］通过meta 分析综合研究发现氮素施用会降低土壤微生物多样性。本研究中减施氮肥降低了细菌群落均匀度指数，变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门是门水平上的3 个主要优势细菌群落。陈玲等[34］的稻虾共作试验研究表明，变形菌门、放线菌门、蓝细菌门为主要优势菌群。理鹏等[35］的有机肥配施研究结果表明，不同处理中丰度最大的菌门均是变形菌门、绿弯菌门和放线菌门。地理位置、土壤类型与耕作方式等的不同会导致稻田细菌群落差异[36］。

3.4 土壤碳氮对微生物群落的影响

有机碳和氮含量是影响真菌群落分布的主要限制因子[37］，土壤碳氮的有效性是决定土壤微生物多样性和功能多样性的重要因素，微生物群落能够通过调节自身的养分利用效率而适应资源的不平衡[38］。本研究中，碱解氮、微生物量氮和可溶性有机碳是微生物群落主要影响因子。赵春梅等[39］研究表明有机碳、有效氮、全氮、碳氮比是影响土壤真菌群落组成的主要因子。本研究中碱解氮、硝态氮、铵态氮和优势细菌群落的相对丰度呈负相关，这可能是农田土壤中增加碳/氮源可促进土壤微生物行使硝化反应、分解纤维素、促进植株生长等功能的细菌其丰度增加，但只增加氮源会降低土壤细菌丰度。