山东 孔德星 孙 茜

在近几年的山东省高考试题中，“基因工程”一直是必考题目之一，试题中与限制酶相关的题目灵活多样，难度较大。因此，笔者结合一些典型例题，对限制酶的考点进行了归纳整理，希望能够提高学生的理解能力和解题能力，为高三学生的备考提供帮助。

一、限制酶的作用

在基因工程中，切割DNA分子的工具是限制酶，这类酶能够识别并切割双链DNA分子中特定的核苷酸序列。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端，通常有两种形式：黏性末端和平末端。切割并不是目的，目的是连接。因此，解题时要注意限制酶识别序列的特点。

【例1】关于如图1所示黏性末端的说法，错误的是

( )

图1

A.甲、乙、丙黏性末端是由不同限制酶作用产生的

B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙不能

C.DNA连接酶的作用位点是b处

D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA片段

【答案】C

【解析】限制酶能识别并切割特定的核苷酸序列。据图1并补充完整限制酶识别序列后可知，甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产生的黏性末端，A正确。根据黏性末端的碱基序列可知，甲、乙单链部分碱基互补可形成重组DNA分子，甲、丙不能形成重组DNA分子，B正确。b是氢键，DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键，不是氢键，C错误。产生甲黏性末端的限制酶识别的序列是5′-GAATTC-3′。甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子的序列是5′-CAATTC-3′，由于限制酶具有特异性，因此切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA片段，D正确。

【补充说明】切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制酶称为同尾酶。两个同尾酶切割的DNA片段连接后，一般情况下，不能再被原来的限制酶识别。

二、限制酶选择的“三不一定位”原则

1.不破坏

基因表达载体中包含启动子、终止子、复制原点、目的基因和标记基因等组件。启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，可以驱动转录；终止子用于终止转录；复制原点是DNA复制的特定起始位点；标记基因便于重组DNA的筛选。以上组件在目的基因的复制和表达中均具有重要的作用，均不能被破坏，因此酶切位点位于组件内部的限制酶都不能使用。当然基因表达载体中往往有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，以用于重组DNA的鉴定和筛选。

2.不自身环化

如果使用一种限制酶切割目的基因和载体，往往会出现自身黏性末端互补连接的情况，为了避免出现自身环化的现象，一般选择两种限制酶分别切割目的基因的上下游，产生不同的黏性末端。同时使用这两种限制酶切割载体，以便目的基因和载体相连。

3.不反向连接

DNA的两条链分别是模板链和非模板链，其中的脱氧核苷酸的排列顺序不同，因此不能颠倒。目的基因和载体连接以后只有正确的连接顺序才能保证目的基因的复制与表达。例如使用一种限制酶切割目的基因和载体，目的基因两侧就会形成相同的黏性末端，所以目的基因和载体就会有正向和反向连接的两种情况。

【例2】图2甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是

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图2

A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA

B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因

C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接

D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长

【答案】D

【解析】在构建重组质粒时，需要选择相同的限制酶切割外源基因和质粒，分析图2甲和乙，质粒和外源基因中相同且不会破坏目的基因的限制酶是PstⅠ和HindⅢ，并且质粒上能够保留一个完整的标记基因，A正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，要保证切割后的质粒至少保留一个标记基因，以便进行筛选，B正确；若只用一种限制酶处理质粒和外源DNA分子片段，因为产生的黏性末端相同，故无法避免自身环化和反向连接，C正确；本题只能使用PstⅠ和HindⅢ切割，用PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏了，因此导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。

4.“一定位”

基因工程中，所选用的限制酶酶切位点应位于启动子和终止子之间；若是质粒上存在T-DNA，酶切位点应位于T-DNA中，从而有利于目的基因嵌入其中，随质粒或T-DNA复制和表达。因此，还可以根据特殊的酶切位点选择限制酶。

【例3】(2021年，山东卷，第25题节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图3所示。

图3

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图3可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。

【答案】(1)SalⅠEcoRⅠ 6

【解析】对于基因工程的题，一般要分析基因的位置，基因的上下游(因为上下游要添加引物)，还有基因的方向以及限制酶的识别序列。根据题干分析，从箭头的方向以及终止子所在的位置可知，γ基因和荧光蛋白基因方向是相反的。限制酶MunⅠ与EcoRⅠ是同尾酶；限制酶XhoⅠ与SalⅠ是同尾酶，识别并切割后的黏性末端相同。要将调控序列和启动子插入载体指导荧光蛋白基因表达，一定要将引物添加在F1的上游(左侧)和R的上游(右侧)。

在荧光蛋白基因上游进行切割有两种限制酶的组合：限制酶MunⅠ与EcoRⅠ和限制酶MunⅠ与XhoⅠ，但由于限制酶MunⅠ与EcoRⅠ是同尾酶，会发生自身连接，因此不能使用。所以，切割荧光蛋白基因上游只能使用限制酶MunⅠ与XhoⅠ。根据限制酶选择的“三不一定位”原则，不能直接使用限制酶MunⅠ与XhoⅠ切割引物，因此只能使用同尾酶，分别是限制酶EcoRⅠ和SalⅠ。限制酶EcoRⅠ识别的位点对应的是R的上游(右侧)位置；限制酶SalⅠ识别的位点对应的是F1的上游(左侧)。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶。因此，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。

三、根据切割后电泳片段，推导酶切位点

1.电泳

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。

2.推断方法

(1)DNA分子为链状。若限制酶切割后电泳出现两条电泳条带，则说明该DNA分子中含有一个限制酶的酶切位点；同理若限制酶切割后电泳出现三条电泳条带，则说明该DNA分子中含有两个限制酶的酶切位点，以此类推。

(2)DNA分子为环状。若限制酶切割后电泳出现一条电泳条带，则说明该DNA分子中含有一个限制酶的酶切位点；若限制酶切割后电泳出现两条电泳条带，则说明该DNA分子中含有两个限制酶的酶切位点，以此类推。

【例4】(2022·山东菏泽)在生物DNA的测序工作中，需要将某些限制性内切核酸酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点，这项工作叫作“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：分别用限制酶HindⅢ、BamHⅠ以及两者的混合物降解一个4 kb(1 kb=1 000碱基对)大小的线性DNA分子，并将降解产物分别进行凝胶电泳。在电场的作用下，降解产物分开，如图4所示。据此分析，这两种限制性核酸内切酶在该DNA分子上的限制位点数目是

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图4

A.HindⅢ1个，BamHⅠ2个

B.HindⅢ2个，BamHⅠ3个

C.HindⅢ2个，BamHⅠ1个

D.HindⅢ2个，BamHⅠ2个

【答案】A

【解析】据图4分析，限制酶HindⅢ将DNA切割为2段(2.8 kb和1.2 kb)，故限制酶HindⅢ有一个切点，BamHⅠ将DNA切割为3段(1.8 kb、1.3 kb、0.9 kb)，表明BamHⅠ有2个切点，分别在离该DNA一端0.9 kb处和2.2 kb处，同时用两种酶切割，则限制酶HindⅢ将该DNA切割为2段(2.8 kb和1.2 kb)，BamHⅠ再将2.8 kb这段DNA切割为2段(1.8 kb和1.0 kb)，将1.2 kb切割为2段(0.9 kb和0.3 kb)。因此选A。

3.推断酶切片段的长度

对限制酶切割结果的考查，除了考查酶切位点的数量以外，还会判断酶切片段的长度。这一类题往往通过画图来帮助学生分析得出正确的结论。

【例5】用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，如图5(其中*表示EcoRⅤ限制酶切割后的一个黏性末端)。

图5

若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段的长度为

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A.2.5和5.5 B.2.5和6

C.5.5和8 D.6和8

【答案】D

【解析】用限制酶EcoRⅤ单独切割某普通质粒，可产生14 kb(1 kb即1 000个碱基对)的长链，说明质粒中含有1个EcoRⅤ切点；同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，通过画图分析，可得到三种长度的DNA片段，说明质粒中含有2个MboⅠ切点。若用MboⅠ限制酶单独切割该普通质粒，则产生的DNA片段为2种，总长度为14 kb，因此选D。酶切位点分布可能如图6。

图6