刘丹阳，徐遵涛,2，丁 勇*

(1 中国科学技术大学 生命科学学院，合肥 230027;2 安徽省农业科学院，合肥 230031)

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的标志，适当的开花时间是高等植物有性繁殖成功的基础[1-2]。植物的开花时间受到内部环境和外界环境共同调控，主要的调控途径可分为光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和温度途径，这些途径协同作用，精确调控拟南芥的成花转变过程[3-5]。

作为开花通路中关键的开花抑制基因，FLOWERINGLOCUSC(FLC) 编码一类MADS box转录因子，通过直接抑制2个开花通路整合因子FLOWERINGLOCUST(FT) 和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1) 的转录来抑制开花[6-8]。FLC受到春化途径和自主途径的调控。在春化过程中，VERNALIZATION 5 (VRN5)、VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3) 和VERNALIZATION 2 (VRN2) 等形成的PHD-PRC2复合体，对FLC位点表观沉默，抑制FLC表达从而促进开花[8]。而在自主途径中，FCA、FY、FPA、Flowering locus VE (FVE)、FLOWERING LOCUS K (FLK) 和FLOWERING LOCUS D (FLD) 通过RNA的代谢和染色质状态的调控，抑制FLC转录[9]。

N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine, m6A) 就是腺苷酸第6位氮原子上的氢原子被甲基所替换，这一修饰在RNA修饰中的比例高至80%，在mRNA中的比例达到50%[10]。m6A修饰由甲基转移酶、去甲基化酶和m6A“阅读器”共同参与。m6A“阅读器”识别并结合m6A修饰的RNA，影响其行使生物学功能。

哺乳动物中YTHDF (YTH domain family) 家族蛋白是一类YTH (YT521-B homology) 结构域蛋白，包括YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，它们能够识别并结合m6A修饰的RNA，具有不同的生物学功能。相关研究表明，YTHDF1促进mRNA的翻译，YTHDF2促进mRNA的降解，而YTHDF3同时促进翻译和降解[11-14]。拟南芥中的ECT蛋白家族是YTHDF家族的同源蛋白。现有研究表明，ECT可参与拟南芥生长发育和胁迫响应的调控。ECT2可调控拟南芥的毛状体分枝数量，这一调控作用依赖于其m6A结合能力[15-16]。此外，ECT2、ECT3和ECT4共同作用，控制叶片形成时间和叶片形态发育[17]。热处理后ECT2进入应激颗粒中，这表明ECT可能参与胁迫响应[15]。然而，拟南芥ECT家族基因能否参与调控开花时间，尚未见报道。

本研究通过qRT-PCR的方法，对开花相关基因ECT6和ECT7参与拟南芥开花时间的调控进行分析，初步探讨了ECT6和ECT7调控开花时间的分子机理，为研究ECT家族和m6A在开花调控中的功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本研究材料为野生型拟南芥哥伦比亚生态型 (Col-0)，T-DNA插入突变体ect6-1 (SAIL_76_D06)、ect6-2 (SALK_083381)、ect7-1 (SALK_203118)和ect7-2 (SALK_105881) 购自美国ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) 种子库。研究中用到的双突变体材料ect6-1ect7-1和ect6-2ect7-2通过突变体杂交获得。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组提取与基因型鉴定(1)基因组提取：取生长20 d左右的野生型和突变体幼苗，利用CTAB法提取其基因组。加入CTAB溶液并高速破碎，通过氯仿萃取、异丙醇沉淀、75%乙醇沉淀以提取得到拟南芥基因组。

(2)基因型鉴定：分别在目的基因的基因组上T-DNA插入位点两侧(LP和RP)和T-DNA插入区段上 (BP) 设计引物，通过三引物法进行PCR鉴定(表1)。T-DNA的长度较长，大于10 kb，PCR无法跨T-DNA扩增出条带。因此，野生型的两条染色体上均没有T-DNA插入，可扩增出以LP+RP为引物的条带(一条带，约900 bp)；纯合突变体的两条染色体上均有T-DNA插入，可扩增出以BP+RP为引物的条带(一条带，约400～700 bp)；杂合子：等位基因的一条染色体上有T-DNA插入，而另一条染色体上无T-DNA插入，不仅能扩增出以LP+RP为引物的条带，还能扩增出以BP+RP为引物的条带(两条带)。PCR反应体系 (20 μL)：0.2 μL EasyTaq，2.0 μL 10×EasyTaq Buffer，0.4 μL LP，0.4 μL RP，0.4 μL BP，0.4 μL dNTP，2 μL模板和14.2 μL ddH2O；反应程序：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，其中变性、退火、延伸步骤循环34次。

1.2.2 RNA提取、半定量及qRT-PCR分析(1)RNA提取：取生长14 d的野生型和ect6ect7双突变体幼苗，加入液氮研磨至粉末状，采用Trizol (TransGen Bio-tech) 试剂提取植物叶片总RNA，并反转录为cDNA。

(2)半定量检测：按照PCR反应体系扩增内参基因Tublin和目的基因(表1)。通过调整模板cDNA的加入比例，以使野生型和突变体中内参基因Tublin的表达量一致，比较野生型和突变体中目的基因的表达量。

(3)qRT-PCR分析：在qPrimerDB网站上进行qRT-PCR引物设计(表1)，采用SYBR superMIX试剂盒 (TransGen Bio-tech)，利用定量PCR仪器 (Bio-Rad) 扩增，以UBQ为内参，并通过2-ΔΔCt计算相对表达量。其中，qRT-PCR反应体系 (20 μL)：10 μL 2×Mix，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，3.0 μL模板cDNA和6.6 μL ddH2O；反应程序：预变性95 ℃ 5 min，循环反应95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，运行40个循环，融解曲线为95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

表1 PCR和qRT-PCR的引物序列

1.2.3 载体构建对pCAMBIA2300-35S∷eGFP载体进行双酶切(酶切位点为SalⅠ和XbaⅠ)并胶回收酶切后的载体。利用引物设计软件Primer Premier 5进行引物设计，上游引物为载体上的序列 (15 bp) +SalⅠ 酶切位点 (6 bp) +目的片段上的上游引物 (24 bp)，下游引物为载体上的序列 (15 bp) +XbaⅠ 酶切位点 (6 bp) +目的片段上的下游引物 (24 bp)，PCR扩增目的片段。将酶切后的载体与目的片段同源重组，以获得融合GFP标签的过表达载体。

1.2.4 烟草注射与亚细胞定位观察将融合GFP标签的过表达载体电转至农杆菌GV3101中，28 ℃培养3 d，活化后3 300 r/min离心弃上清。用烟草转化液重悬菌体，调OD值至0.7。含过表达载体的农杆菌与含P19的农杆菌(促进异源蛋白表达)等体积混合，室温避光放置2 h，注射烟草叶片。弱光培养48～72 h，撕取叶片下表皮细胞置于载玻片上，加入细胞核染色液DAPI，于共聚焦显微镜 (ZEISS Xradia 880) 下观察荧光信号并捕捉荧光图像。

1.2.5 开花表型观察与分析将野生型和突变体拟南芥种植在22 ℃ 长日照(16 h光照/8 h黑暗)或短日照(16 h黑暗/8 h光照)温室，观察抽薹时间，统计25株以上莲座叶和茎生叶数量，以总叶片数的平均值作为开花时间的统计值。

2 结果与分析

2.1 ect6与ect7突变体获得与表型观察

为了研究ECT6与ECT7的生物学功能，首先从拟南芥ABRC种子库订购了T-DNA插入突变体ect6-1 (SAIL_76_D06)、ect6-2 (SALK_083381)、ect7-1 (SALK_203118) 和ect7-2 (SALK_105881)。ect6突变体的2个株系ect6-1和ect6-2分别插入在ECT6基因的第3和第5外显子(图1，A)。为了确认这两种突变体是ECT6功能缺失突变体，首先在基因组水平上进行基因型鉴定。分别在ECT6基因的基因组上T-DNA插入位点两侧(LP和RP)和T-DNA插入区段上 (BP) 设计引物，通过三引物法进行PCR鉴定发现：Col-0可以扩增出LP+RP的条带，而ect6突变体只能扩增出BP+RP的条带，表明ect6突变体是纯合突变体(图1，B)。ect7突变体的2个株系ect7-1和ect7-2。分别插入在ECT7基因的第6和第4外显子(图1，A)。同样对ect7突变体进行三引物法鉴定，发现ect7突变体也是纯合突变体(图1，B)。半定量PCR结果显示，能从Col-0植株中扩增出ECT6和ECT7的全长转录本，而突变体ect6和ect7分别无法扩增出ECT6、ECT7的全长转录本，表明突变体ect6和ect7是完全敲除突变体(图1，C)随后将ect6和ect7突变体分别种植在长日照条件下观察表型并统计叶片数。发现与Col-0相比，ect6和ect7突变体均表现出叶片数减少和开花时间提前(图1，D、E)。结果表明：ECT6和ECT7基因的功能缺失会促进拟南芥的成花转变，使拟南芥植株提前开花。

A.ECT6和ECT7的基因结构及突变体插入位点示意图：空心方框表示UTR，实心方框表示外显子，黑色直线表示内含子，倒三角表示T-DNA插入位点；B. 突变体的基因型鉴定；C. 突变体的半定量鉴定；D. 长日照下ect6突变体表型和叶片数；E. 长日照下ect7突变体表型和叶片数；采用Student’s t test进行显著性检验 (* P < 0.05)

2.2 ect6 ect7双突变体的表型观察

ECT6与ECT7基因在功能上可能存在冗余，因此，将突变体ect6与ect7进行杂交，得到ect6ect7双突变体。接下来将Col-0、ect6-2、ect7-2和ect6-2ect7-2突变体种植在长日照条件下观察表型。发现与Col-0相比，ect6-2、ect7-2和ect6-2ect7-2双突变体均表现出早花表型，并且ect6ect7双突变体的早花表型比ect6-2和ect7-2突变体更加显著，叶片数也更少(图2，A)。这一结果表明ECT6与ECT7基因功能冗余，共同调控开花。在短日照条件下，ect6ect7双突变体也具有早花的表型(图2，B)。这些结果表明：ECT6与ECT7并非通过光周期途径来调控开花。

A.长日照下ect6 ect7双突变体表型和叶片数；B. 短日照下ect6 ect7双突变体表型和叶片数；采用Student’s t test进行显著性检验 (* P < 0.05)

2.3 ECT6和ECT7亚细胞定位

将ECT6和ECT7分别与GFP标签融合，利用烟草瞬时转化系统对ECT6和ECT7蛋白进行亚细胞定位的观察。发现ECT6和ECT7的GFP荧光信号与细胞核染料DAPI的荧光信号存在重叠，此外，部分GFP荧光信号分布于细胞质中(图3，A、B)。结果表明：ECT6和ECT7均分布在细胞核和细胞质中。

图3 ECT6 (A) 和ECT7 (B) 的亚细胞定位

2.4 关键开花相关基因检测

为了解析ect6ect7双突植株呈现早花表型的分子机制，检测14 d龄幼苗中成花素基因FT的表达水平，结果表明，ect6ect7双突变体中FT的表达水平显著高于野生型(图4，A)，这与在突变体中观察到的早花表型一致(图2，A)。考虑到长、短日照条件下表型的一致性，推测突变体中FT的升高可能是通过FLC调控的，因此检测了FLC的表达水平，发现双突变体中FLC的表达水平显著低于野生型(图4，A)。FLC可同时受到春化途径和自主途径的调控，进一步检测春化途径和自主途径关键基因的表达水平，发现春化通路基因VIN3、VRN2和VRN5在ect6ect7双突变体中的表达水平均显著高于野生型(图4，B)。自主途径关键基因FPA、FLK、FLD、FCA和FY的表达水平在野生型和突变体之间无显著差异，而ect6ect7双突变体中FVE基因的表达水平显著高于野生型(图4，B)。

A.FT和FLC的表达；B.春化途径和自主途径关键基因的表达；采用Student’s t test进行显著性检验 (* P < 0.05, ** P < 0.01)

这些结果表明：ECT6和ECT7可通过FLC来调控成花素基因FT的表达水平，从而调控成花转变，并且ECT6和ECT7对FLC的调控依赖于春化途径和自主途径。

3 讨 论

m6A是高等真核生物mRNA上含量最丰富的转录后修饰[10]。m6A的生物学功能往往依赖于m6A结合蛋白。在哺乳动物中，YTHDF家族是m6A的结合蛋白，分别为YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。它们通过识别并结合mRNA上的m6A修饰，调控mRNA的翻译和降解来发挥功能[11-14]。而模式植物拟南芥中的ECT家族同样包含YTH结构域，被预测为m6A的“阅读器”。拟南芥中的ECT家族共包含11个成员[15]，数量远大于哺乳动物，这表明拟南芥中的ECT家族基因很可能存在一定的功能冗余和功能分化。

之前的研究表明，拟南芥ECT家族基因参与生长发育和胁迫响应的调控。ECT2通过其m6A识别能力来影响毛状体分枝数量[15-16]。ECT2、ECT3和ECT4功能冗余，共同调控叶片形成时间和叶片形态[17]。ECT2在常温下定位在细胞质中，热处理后定位至应激颗粒中[15]。此外，有研究发现ECT1和ECT2可与胁迫响应蛋白calcineurin b-like-interacting protein kinase 1 (CIPK1) 特异性相互作用，暗示ECT1和ECT2可能与胁迫响应相关[18]。然而关于拟南芥ECT家族的其他成员未见报道，并且ECT是否参与开花调控尚不清楚。我们的研究表明：ECT6和ECT7的功能缺失导致早花表型，表明ECT6和ECT7参与拟南芥开花时间的调控。

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的过程，合适的开花时间对于植物成功繁衍后代非常关键。FLC是开花通路中关键的开花抑制因子，通过调控下游的FT来抑制开花。我们的qRT-PCR结果显示，在ect6ect7双突变体中，FLC的表达水平与Col-0相比显著下调，而FT的表达水平显著上调(图4，A)，这与我们观察到的ect6ect7双突变体的早花表型一致。

上游的春化途径以及自主途径共同调控FLC的表达。在春化过程中，VRN2被诱导表达，VRN2、VIN3与VRN5相关联，通过调控FLC的染色质状态来抑制FLC的转录[19-22]。自主途径中的FVE可通过调控FLC的乙酰化水平来抑制FLC的表达[23]。因此，我们也检测了春化途径和自主途径中相关基因的表达水平。发现在ect6ect7双突变体中，FLC抑制基因VIN3、VRN2、VRN5和FVE的表达水平显著上调(图4，B)，这很好地解释了突变体中FLC表达水平显著下调。虽然ECT6和ECT7通过影响这些基因的表达间接调控FLC的转录，但并不能排除ECT6和ECT7作为m6A的“阅读器”，通过直接结合m6A修饰的FLCmRNA来调控FLC转录本的稳定性，实现对FLC和开花时间的调控。在未来的工作中，我们需要对FLCmRNA是否存在m6A修饰及ECT是否与之结合进行探索。

综上所述，本研究初步解析了拟南芥ECT6和ECT7在开花时间调控中的生物学功能，揭示了拟南芥ECT基因存在功能冗余和分化，为进一步研究m6A/ECT在植物生长发育中的功能提供线索。