王志安，魏太平，罗晓丽，肖娟丽，刘 圆，张安红*

(1 山西农业大学 棉花研究所，山西运城 044000；2 中国科学院 微生物研究所，植物基因组国家重点实验室，北京 100101)

棉花属于锦葵目锦葵科棉属植物，作为全球主要的农作物之一，是重要的纺织和化工原料，也是重要的战略物资。棉花生长和产量的稳定对国民经济具有重要的意义[1-2]。然而，棉花在整个生长发育阶段易受到多种害虫的危害，主要包括棉铃虫、蚜虫、盲蝽蟓等。研究棉花的抗虫机制对培育抗虫新品种具有一定的指导意义。

化学农药因防治成本低，能快速有效地控制害虫危害，被广泛应用于农业生产中，但是大量施用化学农药会造成农药残留，已成为农业面源污染的重要来源之一[3-4]。同时，化学农药的化学性质稳定，降解困难，持续大剂量的应用不仅导致土壤污染，也会通过饮用水或土壤-植物系统经食物链进入人体，危害人体健康[5]。因此，选育广谱抗虫棉花品种是最环保和有效的手段之一，抗虫棉花品种的选育首先需要挖掘和鉴定相应的抗虫基因或蛋白，故当前克隆和分析抗虫候选基因成为一个研究热点。

木质素广泛存在于植物中，是细胞壁的重要组成部分，其重要功能主要包括木质部导管运输水分和矿物质营养，以及对病原菌和昆虫入侵的防御[6]。木质素是植物的一种重要的次生代谢聚合物，主要由苯丙环路径的合成代谢途径生成，其最后一步关键反应是由植物漆酶决定[7]。植物漆酶(laccase，LAC)是一种多聚氧化还原酶，属于蓝铜氧化酶家族，能够促进木质素单体聚合，影响植物的生长与发育，并且一些漆酶基因的表达与木质部木质素沉积密切相关。同时，木质素也是植株抵御病原菌和病虫入侵的重要屏障[8-10]。研究表明，有些LAC基因能够被miR397调控。Zhang等[11]发现miR397可通过调节OsLAC基因影响水稻对黄藓类固醇(BR)的敏感性反应，增加水稻穗数。Lu等[12]发现ptr-miR397通过调节漆酶基因影响毛果杨木质素含量从而影响木质素的合成。Wang等[13]和Yamasaki等[14]研究发现3个漆酶基因LAC2、LAC4和LAC17有可能是拟南芥miR397的直接靶标，并且miRNA介导的漆酶表达可能在木质素生物合成中发挥着重要作用。Cho等[15]研究发现，OsChI1基因编码一种漆酶前体蛋白，过表达OsChI1(chitinase 1)-EGFP(enhanced green fluorescent protein)的转基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的耐受性增强。这些报道表明miR397与LAC一起参与木质素合成，木质素能够加固植物细胞壁和导管，从而使植物更好地在逆境中生存。然而关于棉铃虫漆酶报道相对较少，相关研究证明棉铃虫的漆酶主要参与虫子表皮的黑化和硬化，也有少数报道表明棉铃虫漆酶能够参与对木质素的降解作用[16-17]。

本研究分析棉花漆酶基因LAC4受miR397的调控机理，并通过表达ghr-miR397和沉默GhLAC4分析其在植物应对棉铃虫中的作用。因此本研究拟阐明棉花miR397-LAC4模块调控木质素合成和抗虫分子机制，为培育高抗病棉花品种提供研究基础，同时也带来许多环境、社会和经济利益，包括减少化学农药和杀虫剂的使用、间接增加产量、最小化环境污染以及减少劳动力和成本。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培养

经硫酸脱绒过的棉花种子浸泡在水中，37 ℃培养箱过夜后放至培养盒中，保持种子湿润情况下黑暗处萌芽。取发芽一致的种子转至Hoaglands培养盒中或种植到营养土中，于室温28 ℃、16 h光照/8 h黑暗培养箱中进行培养。

1.2 方 法

1.2.1 植物组织RNA的提取和实时定量PCR取棉花组织的样品于灭菌的研钵中加入液氮迅速研磨，待样品磨碎后分装于无酶离心管中，随后使用Trizol试剂从棉花植物中提取总RNA，通过使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(北京擎科生物有限公司)将RNA进行逆转录合成cDNA。mRNA引物设计、第一链cDNA合成分析均参照Varkonyi-Gasic等方法[18]。qPCR实验则根据2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)试剂盒使用说明(北京擎科生物有限公司)进行操作，来自棉花的U6和UBQ7基因用作棉花miRNA和其他基因标准对照。最后使用2-ΔΔCT方法来确定相对表达水平。

1.2.2 载体构建烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)相关的载体构建可参照Liu等[19]和Sha等[20]文献。为了构建ghr-miR397沉默的棉花植物的载体，设计一个小串联靶模拟(short tandem mimicry technology，STTM)序列，其中包含一段48 nt序列，两端连接两段短的重复序列模拟靶标，其5′和3′端酶切位点分别为XbaⅠ和BamHⅠ，插入到pTRV2e载体中生成TRV:STTM397载体。从棉花基因组中克隆棉花miR397基因并插入pTRV2e载体，构建TRV:OE-miR397载体，生成TRV-miR397过表达的棉花植物。VIGS载体构建可参照Pang等[21]文献。为了获得VIGS技术沉默GhLAC4基因的植株，选用GhLAC4(Gh-A03G0417)基因特异性片段，设计正反向引物，并在引物两端分别加上KpnⅠ、BamHⅠ酶切位点，插入到pTRV2载体中，构建沉默GhLAC4载体，所以质粒均需电转至农杆菌GV3101，挑取阳性克隆，将阳性菌液扩繁。用甘油(50%)保存后放-80 ℃备用。

将GhLAC4和GhLAC4突变体(GhLAC4mu，ghr-miR397靶序列突变)与pBI121载体的GUS基因融合，分别得到GhLAC4:GUS和GhLAC4mu:GUS载体。将miR397的前体序列插入pCAMBIA1300中，在35S启动子的驱动下生成pCAMBIA1300-miR397。所有的质粒采用电击法转入农杆菌GV3101。将含有上述载体的农杆菌培养在含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL庆大霉素和50 μg/mL利福平的LB培养基中，在28 ℃下培养过夜。收集农杆菌细胞，在MMA溶液(10 mmol/L 2-吗啉乙醇磺酸、10 mmol/L氯化镁和200 mmol/L乙酰丁香酮、OD600为1.2)中重悬。将含有上述载体的农杆菌细胞与pYL192均匀混合，在室温黑暗中孵育2 h。最后，参照Tang等[22]所述，对植物进行农杆菌渗透。所有与载体构建相关的引物均列于表1。

表1 研究中涉及到的引物

1.2.3 棉花组织化学染色为观察木质部发育和木质素沉积，采用Wiesner reagent进行组织化学染色[23]。手工将3个以上的棉花第一节间切片，厚度小于0.3 cm，选择较为完整一致的切片加入1%间苯三酚染色液处理10 min，清除间苯三酚液体后加18%盐酸处理20 min，用体式显微镜(DM2500；徕卡，德国)观察和拍照。

1.2.4 木质素含量测定采用Klason法[24]测定不同处理下植物的第一个节间的木质素含量。剪取植株第一节间于液氮下研磨，取400 mg样品放在50 mL无酶EP管中，加45 mL甲醇，于200 r/min摇床振荡过夜，次日于6 000 r/min离心10 min后去除上清；重复上述步骤，振荡2 h即可；将得到的样品在80 ℃下烘干，样品重量约200 mg(A1)，加入4 mL的72% H2SO4，于30 ℃ 水浴下1 h；转移至250 mL锥形瓶中加112 mL蒸馏水，95 ℃ 水浴1 h，水浴期间维持水位刻度线，补充水；将滤纸烘干称重(A2)，过滤上述水浴样品烘干称重(A3)。木质素含量=(A3-A2)/A1×100%。该实验3次重复。

1.2.5 棉铃虫的选择性和非选择性取食实验1)非选择性实验。通过测定棉铃虫幼虫在GhLAC4沉默植株(TRV:GhLAC4)、miR397过表达植株(TRV:OE-miR397)、miR397沉默植株TRV:STTM397和对照植株(利用空载体进行进行沉默表示为TRV:00)上取食48 h后的体重增长情况，以反映棉花植株对棉铃虫的抗性。具体方法：选取生长发育和体重一致的2日龄棉铃虫，置于棉花植株叶片上，取食48 h后取下棉花上的棉铃虫，用天平称重。

2)选择性实验。为观察不同处理棉花材料对棉铃虫的抗性，测试棉铃虫取食偏好性，分别将65只生长发育和体重一致的2日龄棉铃虫，TRV:GhLAC4、TRV:OE-miR397、TRV:STTM397和对照植株放入透明的容器内且避光，观察棉铃虫的取食偏好性，48 h后取下棉花上的棉铃虫，用天平称重，且统计叶片的取食面积和虫子数量[25]。

2 结果与分析

2.1 GhLAC4基因调控棉花对棉铃虫的抗性分析

为了研究GhLAC4的抗虫功能与棉花植株木质素合成积累的关系，利用烟草TRV沉默系统构建沉默GhLAC4载体，转化农杆菌GV3101，注射棉花子叶，培育GhLAC4沉默植株(TRV:GhLAC4)。对这些棉株的茎秆切片进行间苯三酚-HCl染色反应(酸性条件下间苯三酚与木质素发生反应，木质部变成红紫色)，观察切片木质部颜色情况。结果显示：TRV:GhLAC4植株比TRV:00植株着色浅，表明沉默GhLAC4基因会减少木质素积累(图1，A)。利用Klason法测定植株的木质素含量，相较于对照植株，GhLAC4沉默植株的木质素含量显著减少(图1，B)。这些结果暗示GhLAC4沉默植株，由于GhLAC4基因沉默其木质素含量减少。

A.植株中茎切片的间苯三酚-HCL染色图，黑色箭头示红色方框木质部的放大区域，标尺=350 μm；B.棉株木质素含量测定；C、D.棉铃虫叶片取食面积及48 h后统计；E.棉铃虫取食后重量统计；平均数(标准误)来自于3个生物学重复，**表示处理组植株和对照组植株有显著性差异(**P < 0.01)

为了验证GhLAC4沉默植株的棉铃虫抗性减弱，进行了非选择性棉铃虫实验。结果显示，接种棉铃虫48 h后统计棉花叶片的取食面积，GhLAC4沉默植株的取食面积显著高于对照植株的取食面积(图1，C、D)。统计接种棉铃虫24 和48 h后棉铃虫重量(图1，E)，结果显示，取食GhLAC4沉默植株的棉铃虫重量明显高于对照植株。综合认为，GhLAC4沉默植株的木质素含量减少，降低了棉花对棉铃虫的抗性，表明GhLAC4正调控棉花对棉铃虫的抗性。

2.2 ghr-miR397调控棉花对棉铃虫的抗性分析

为进一步研究ghr-miR397在陆地棉中的抗虫功能，利用TRV沉默系统和STTM技术构建沉默ghr-miR397载体和过表达载体，转化农杆菌GV3101，注射棉花子叶，培育ghr-miR397沉默植株(TRV:STTM397)和过表达植株(TRV:OE-miR397)。间苯三酚染色结果表明，与棉花对照植株TRV:00相比，棉花TRV:OE-miR397植株木质部的染色较浅，而TRV:STTM397染色明显，颜色更深(图2，A)。Klason法检测的棉花TRV:OE-miR397植株中的木质素含量显著低于TRV:00棉花植株，而TRV:STTM397棉花植株中的木质素含量显著高于TRV:00棉花植株(图2，B)。由此说明，过量表达miR397可以减少棉花植株木质素积累，而沉默miR397增加木质素积累。

为探究ghr-miR397过表达和沉默植株的木质素合成和积累对植株抗虫功能的影响，对TRV:OE-miR397和TRV:STTM397植株进行了棉铃虫抗性测定。棉铃虫非选择性实验表明，ghr-miR397过表达植株对棉铃虫抗性减弱，而ghr-miR397沉默植株对棉铃虫抗性增强。接种棉铃虫48 h后棉花叶片被食面积统计，ghr-miR397过表达植株棉铃虫取食面积明显大于对照植株。而ghr-miR397沉默植株棉铃虫取食面积明显小于对照植株(图2，C、D)。这可能与不同处理下植株的木质素积累有关。取食棉花叶片24和48 h后棉铃虫重量统计显示，ghr-miR397过表达植株棉铃虫显著重于对照植株，而ghr-miR397沉默植株棉铃虫显著轻于对照植株(图2，E)。

A.棉花茎秆切片间苯三酚-HCL染色，黑色箭头示红色方框木质部的放大区域，标尺=350 μm；B.棉花植株木质素含量测定；C、D.棉铃虫叶片取食面积及48 h后统计；E.棉铃虫取食后重量统计；平均数(标准误)来自于3个生物学重复；B、D图中，*和**表示处理组植株和对照组植株有显著性差异(*P < 0.05, **P < 0.01)，E图中，不同小写字母表示差异显著性(P < 0.05)

2.3 棉花miR397-LAC4调控植株抗虫性分析

为了进一步探究miR397-LAC4对棉铃虫的抗性，进行选择性实验以检测棉铃虫对不同处理植株的取食偏好性。结果显示，棉花叶片接种棉铃虫48 h后，棉铃虫更偏向取食GhLAC4沉默植株和ghr-miR397过表达植株，其次是对照植株，最后才是ghr-miR397沉默植株(图3，A)。接种48 h后统计棉花叶片的取食面积，GhLAC4沉默植株和ghr-miR397过表达植株棉铃虫取食面积明显大于对照植株，而棉铃虫取食来源于ghr-miR397沉默材料叶片的面积大于对照植株(图3，B)。接种棉铃虫后12、24和48 h不同处理植株叶片上棉铃虫个数统计也与上述结果相一致(图3，C)。因此，沉默GhLAC4和过表达ghr-miR397降低棉花的木质化作用，降低其对生物胁迫的耐受性。而沉默ghr-miR397棉花植株细胞壁的木质化增强、木质素含量增加，提高了棉花植株对棉铃虫的抗性。

A.棉铃虫取食情况；B棉铃虫取食面积(48 h后)统计；C.棉铃虫取食后重量统计；平均数(标准误)来自于3个生物学重复，不同小写字母表示差异显著性(P < 0.05)

3 讨 论

目前用于生产棉花的抗虫转基因大多数为Cry1Ab和Cry1Ac，抗性基因品种单一，容易使害虫产生抗性[26]。近年来，相关研究分离出对棉铃虫等鳞翅目害虫具有杀虫效果的基因，但是多集中在基因的克隆和功能分析阶段[27]，也有研究证实了Vip3A和转Bt基因能够在棉花植株内表达，并且具有很好的抗虫效果[28-29]。鉴于此相关研究表明植物木质素通过漆酶聚合单醇沉积在细胞壁中[30]。通过基因实验报道，17个漆酶基因中只有4个在拟南芥的木质素生物合成中起作用。此外，木质素可作为防止致病性入侵和增强植物抗性的屏障[31]。然而，LAC家族基因参与木质素生物合成和植物抗性的功能尚未在miRNA的遗传分析和调控中得到探索。在这里，我们描述了棉花LAC4通过调节miR397和参与植物防御在木质素生物合成中的作用。

本研究发现GhLAC4在木质素的生物合成中起作用。通过木质素含量测定、化学染色，GhLAC4的植株木质素含量较低。虽然植物中有许多LACs，但只有少数参与单酚聚合为木质素。例如，在拟南芥的17个漆酶基因中，根据遗传分析证实，只有LAC4、LAC11、LAC15和LAC17在木质素生物合成中起作用[32]。在害虫的入侵作用下，GhLAC4的表达水平升高，而ghr-miR397的积累减少，导致植物抗性增强。越来越多的证据表明，一些植物LACs，包括参与基础木质素生物合成的LACs，对虫害入侵作出反应，增加细胞壁木质化，导致植物防御增加[7]。过表达GhLAC15可以增加植物细胞壁的木质化和木质素含量，从而提高植物对棉铃虫的抗性[10]。因此，本研究利用ghr-miR397-GhLAC4模块基因获得了高抗棉铃虫棉花材料，在静息状态下，GhLAC4通常作用于木质素生物合成，木质素生物合成沉积在细胞壁中促进植物生长发育，可以为棉花抗虫育种提供新的种质。