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细胞焦亡与细菌感染

2022-11-26马晓宇武小虎王胜义沈文祥宋朋杰严作廷

动物医学进展 2022年6期
关键词:模式识别结构域受体

马晓宇,武小虎,王胜义,杨 洁,沈文祥,宋朋杰,杨 英,严作廷*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州 730050;2.内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018)

细胞焦亡(pyroptosis)主要发生于炎症感染过程中,焦亡后的细胞表现为细胞膜破裂,细胞内容物释放而出并伴随大量炎症因子的成熟和释放。因此,细胞焦亡又被称为细胞炎症性坏死。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,它是由细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别感染病原体的相关模式分子(pathogen-associated model pattern,PAMP),或者机体自身的损伤相关模式分子(damage-associated model pattern,DAMP),进而激活炎症小体(inflammasome)免疫复合物,导致炎症因子,主要为白介素18(interleukin 18,IL-18)和白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)由前体形式转为成熟形式。最后切割具有打孔功能的Gasdermin蛋白家族相关蛋白导致细胞膜破裂,大量细胞内容物和炎症因子被释放,同时可以招募炎症细胞聚集,进而清除病原微生物,保护宿主机体。但过度的细胞焦亡也会对机体有害,可能导致脓毒血症的发生[1-2]。目前研究表明,炎症小体诱导细胞焦亡的方式有两种,分别被称为经典和非经典炎症小体通路。多种细菌均可诱导细胞焦亡,这2种信号通路在不同的细菌性感染中发挥相应的作用[3]。

1 经典炎症小体通路

经典的炎症小体通路通常由以下几个部分组成:模式识别受体,接头蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)。由于经典炎症小体通路效应蛋白均为caspase-1,该通路又可称为caspase-1依赖性炎症小体通路。它们在PAMP或者DAMP的刺激下激活后,可将炎症因子IL-18和IL-1β的前体形式变为其成熟形式,同时,炎症小体还将切割打孔蛋白GSDMD,使其C端和N端分离并在细胞膜上打孔,导致细胞膜破裂,成熟的炎症因子释放。

1.1 模式识别受体

模式识别受体是指先天免疫识别病原入侵并检测组织稳态的一系列受体。与适应性免疫应答不同,PRRs主要识别微生物表面的统一的模式或者保守的序列。这些模式识别受体包括Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)、Nod样受体(NOD-like receptors,NLRs)、C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CLRs)、RIG样受体(RIG-like receptors,RLRs)、Pyrin蛋白、DNA识别受体黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)和细胞内LPS受体Caspase-11(4/5)。它们有的表达于细胞表面(部分TLRs和CLRs等),检测细胞外环境刺激;有的表达于细胞内部(NLRs和RLRs等),可被细胞一些内源性炎症因子激活。其中,与经典炎症小体通路密切相关的模式识别受体分别是TLR(调控作用)、部分NLR、AIM2和Pyrin(直接组成)[4-6]。

Toll样受体是目前研究最多的一类模式识别受体,它是一类跨膜受体,其结构可分为3个部分:细胞外为富含亮氨酸的重复序列(leucine rich repeat,LRR),跨膜部分富含半胱氨酸;胞浆内区域与白介素1(interleukin 1,IL-1)受体同源。其主要表达于细胞膜表面(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6),部分表达于细胞内质网内体膜上(TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)。不同的TLR特异性识别一类PAMP,包括细菌鞭毛蛋白、脂多糖、肽聚糖、单链RNA、双链RNA等。受体和配体结合后,可以通过MyD88、TRIF等激活NF-κB信号通路,进而激活细胞因子相关基因转录。细胞因子激活后可以进一步调控炎症小体信号通路相关蛋白的表达和激活。同时,TLR信号通路激活还可以参与机体的适应性免疫应答,对效应T细胞的发生、分化、记忆细胞形成和抗体的产生等具有多层面的调控能力[7-8]。

Nod样受体是一类表达于细胞内部的受体,其家族的特点是含有一个中央约束力的核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD),其侧翼通常为带着LRR的C端和含有半胱天冬酶募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)或热蛋白结构域(pyrin domain,PYD)的N端。根据功能可将NLR家族分为2组:一组包括NOD1和NOD2,激活各种转录因子(NF-κB、MAPK等),诱导促炎因子(抗菌肽、干扰素等)产生;另一组包括NLRP3、NLRC4等通过LRR接受刺激信号,介导蛋白复合物炎症小体的装配,其中NLRC4可通过N端的PYD与ASC结合,间接招募Caspase,也可通过CARD直接招募效应蛋白,而NLRP3则必须依赖ASC才能招募效应蛋白。另有研究表明,非典型NLR蛋白像AIM2和PYRIN蛋白,也具有形成炎症小体并引起下游分子激活的功能,且其方式与NLR蛋白相同[9-10]。

细菌感染时可以通过不同的PAMP被相应的PRRs识别,进而诱导细胞焦亡来清除细菌。如产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)感染机体或细胞时,细胞外的LM主要被TLRs识别,胞内的LM形式如鞭毛蛋白、Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)等被NLRs和AIM2识别[11-13];沙门氏菌(Salmonella)感染时,可通过自身形成的囊泡破裂释放到巨噬细胞胞质中,其鞭毛蛋白和T3SS可被NOD样受体NLRC4识别,另有研究证明NLRP3也参与了沙门氏菌的识别过程,可与NLRC4发挥协同作用[14-15];同样,嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)也可通过其鞭毛蛋白被NLRC4识别[16]。这些受体被激活后,可通过ASC招募或直接招募Pro caspase-1并将其切割成活化形式,活化后的caspase-1可通过切割IL-1β和IL-18前体使其成熟并分泌到细胞外,从而引起细胞焦亡并招募炎性细胞聚集,扩大炎症反应,进一步激活宿主产生免疫应答,最终清除感染的病原菌[17]。

1.2 炎症小体的激活

炎症小体的激活是细胞焦亡过程的核心反应。在PAMP和DAMP的作用下,受体的C端(LRR)接收到相关信号,受体发生寡聚化(oligomerization)同时其N端(PYD)与接头蛋白(ASC)的N端(PYD)结合,ASC的C端(CARD)可以招募caspase-1前体(pro-caspase-1),使其发生自身切割后形成,3个独立的结构:p10、p20和CARD结构域。caspase-1的活性形式是由2个p10和2个p20形成的异四聚体(也有一些受体N端不含PYD而直接含有CARD,这些受体可不通过ASC直接招募并活化caspase-1)。此时,炎症小体免疫复合物形成并可以将细胞因子(IL-18、IL-1β)由前体形式转化为成熟形式并引发细胞焦亡[18]。

志贺杆菌(Shigella)感染巨噬细胞后,诱导的细胞程序性死亡具有核固缩、DNA断裂,细胞膜完整性受损,通透性改变,胞质空泡化,线粒体膜电位降低和IL-1β分泌增多等细胞焦亡的特征。志贺杆菌诱导细胞焦亡具有其独特的特征,与传统炎症小体激活方式有所区别,这一过程是由志贺杆菌的T3SS效应蛋白IpaB诱导caspase-1激活引起的[19]。另有研究表明,志贺杆菌的T3SS可以分泌IpaH7.8 E3泛素连接酶,使球蛋白(glomulin,GLMN)泛素化并降解,从而通过该途径诱导巨噬细胞的炎症小体激活和细胞焦亡[20]。

1.3 效应蛋白Caspase

Caspases通常以酶原的形式被表达出来,发挥功能时需要被激活。Caspase蛋白N端为Caspase募集结构域(CARD)或者死亡效应结构域(death effector domain,DED),其后为2个亚基(p10和p20)。Caspase激活时进行自切割后可形成,3个独立的结构:p10、p20和CARD结构域。caspase-1的活性形式是由2个p10和2个p20形成的异四聚体。Caspase家族可根据功能不同而分为凋亡起始Caspase亚家族,包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10;凋亡执行Caspase亚家族,包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7;炎症Caspases亚家族,包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11、Caspase-13和Caspase-14[21-22]。

近年来研究表明,除了传统的炎症caspase蛋白,其他的caspase蛋白如Caspase-8也能在细菌感染引起的细胞焦亡过程中发挥重要作用[23]。耶尔森氏菌(Yersinia)感染过程中,其T3SS会分泌许多外膜蛋白(Yersinia outer membrane protein,Yops),这些外膜蛋白具有多种功效:其中YopJ可以抑制MAP激酶家族成员TGF-β激活的激酶1(TGF-β activated kinase 1,TAK1),激活caspase-8从而切割GSDMD导致细胞焦亡[24];另有研究表明,耶尔森氏菌的T3SS可激活NLRP3和NLRC4炎症小体进而导致caspase-1依赖的细胞焦亡,caspase-8也可以调控这一过程[25]。

1.4 打孔蛋白Gasdermin

关于细胞焦亡的研究很早就出现,但以前一直将其和细胞凋亡相混淆,有关炎症小体具体如何介导细胞焦亡的机制直到2015年才通过邵峰实验室[26]和Vishva Dixit实验室[27]的文章揭示:细胞焦亡是由于Gasdermin D(GSDMD)蛋白被活化的Caspase切割激活,使蛋白质N端部分在细胞膜上寡聚并聚集成孔引起细胞膜破裂而导致的。Gasdermin家族其他成员包括Gasdermin A、Gasdermin B、Gasdermin C、Gasdermin D、Gasdermin E和DFNB59。目前研究表明,除了DFNB59,Gasdermin家族其他蛋白均具有细胞打孔功能,GSDMD为细胞焦亡主要执行蛋白,至于Gasdermin家族其他蛋白的具体功能和激活机制,目前同样有研究表明他们可以通过相关效应蛋白caspase的激活来介导细胞焦亡,但其具体的信号通路尚有待于进一步的研究进行揭示[28-30]。

2 非经典炎症小体通路

非经典炎症小体通路又称为Caspase-1非依赖性炎症小体通路,因其效应蛋白为细胞内的LPS直接受体Caspase-11(4/5)。以往的研究认为,LPS只能在胞外刺激TLR4受体进而通过NF-κB信号通路或经典炎症小体信号通路来引起炎症反应,但近来研究发现,在细胞内存在一种LPS直接受体Caspase-11(4/5)。其表达依赖TLR2/3/4受体激活,但其活化则必须有细胞内LPS的参与,Caspase-11(4/5)的活化也不同于Caspase-1的自身切割,而是发生寡聚化。研究表明,Caspase-11(4/5)的活化依赖与LPS的六酰基脂质A和自身CARD结构域。但这些研究中的LPS均是通过转染(电转或者脂质体)而非正常途径进入细胞内[31-33]。因此,关于LPS在生理状态下如何进入细胞成为了研究非经典炎症受体信号通路的关键。目前,关于LPS入胞的猜想有一下2种:①细菌感染过程中,细菌外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMV)中含有高浓度的LPS,可在巨噬细胞网格蛋白(clathrin)介导的内吞作用下形成吞噬体进入细胞后经由鸟苷酸结合蛋白(Guanylate binding protein,GBP)破坏吞噬体囊泡,使LPS暴露在细胞质内。②LPS结合蛋白LBP在LPS入胞中发挥了重要作用,但其具体机制尚不完全清楚[34-36]。

非经典炎症小体的通路构成比较简单,仅有入胞后的LPS作为刺激物,caspase-11(鼠)或caspase-4/5(人)既作为LPS的模式识别受体,又同时可作为效应蛋白直接激活以切割GSDMD。但非经典炎症小体通路不能导致相关炎症因子(IL-18、IL-1β)的成熟,必须依赖经典炎症小体通路的作用。因此,同样有人进行相关研究,认为非经典炎症小体通路同样可以参与经典炎症小体通路中相关免疫复合物(通过K+外流等)的激活[37]。

LPS是革兰氏阴性菌的经典PAMP,研究表明:LPS转染进入细胞后,可以直接激活caspase-11,诱导细胞焦亡[33]。

3 结语与展望

细胞焦亡作为一种新的细胞程序性死亡方式,近年来被许多学者研究,对其分子机制及在细菌感染中的作用有了一定的认识。总体来说,细胞焦亡可在一定程度上抵御细菌的感染,但过度的细胞焦亡可能导致脓毒血症的发生,对机体造成极大的伤害。本课题组主要进行关于奶牛子宫内膜炎的分子病理机制及其治疗方法的研究,而奶牛子宫内膜炎的主要致病因素就是细菌感染。近年来,已有相关研究[38]表明,奶牛子宫内膜炎的分子病理机制可能与细胞焦亡有关,但仍有许多问题尚未解决,有待于进一步的研究。本课题组拟在前人研究的基础上进一步研究子宫内膜炎与细胞焦亡的具体分子病理机制,并试图找出相应的治疗手段。

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