孙 伟，刘杉杉*，周 佳，朱锋钊，高俊波，王靖飞

(1.铜仁职业技术学院/民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心，贵州铜仁 554300；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物病原与病理形态学创新团队，黑龙江哈尔滨 150069)

猪伪狂犬病 (Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种免疫抑制性疾病[1]。PRV可感染猪、牛、羊、鼠等哺乳、反刍和啮齿类动物，引起宿主出现繁殖障碍、腹泻、瘙痒等症状，具有较高的死亡率，给养殖业造成巨大的经济损失[2]。PRV感染引起的脑炎导致猪群出现神经缺陷并诱发死亡[3]。研究表明，PRV均可引起猪和小鼠脑炎，并表现出相似的组织病理变化[4]。我国自实行PRV净化计划以来取得了显著的效果，但该病仍未被根除[5]。

脑是机体内能量需求最高和代谢最旺的的组织，富含丰富的线粒体。脑功能发挥所需的代谢能量完全依赖于线粒体结构、功能以及线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的完整性。线粒体作为细胞内生成ATP的细胞器，在维持脂质、氨基酸、钙稳态，以及调节类固醇代谢和触发细胞凋亡过程中起到重要作用[6]。线粒体功能障碍与能量代谢降低有关，线粒体损伤可导致神经元坏死。脑组织是PRV作用的重要靶器官之一，PRV感染过程对线粒体结构和功能的影响尚缺乏文献报道。因此，本研究以小鼠为模型，初步探讨PRV感染对脑组织线粒体结构和功能的影响，为PRV致病机理的研究提供一定的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株与实验动物 PRV-HLJ株(MK080279.1)由中国农科院哈兽医研究所动物病原与病理形态学创新团队分离并由本实验室保存。6周龄Balb/c小鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供。将小鼠随机分成4组(对照组18只，感染组各6只)，其中对照组皮下注射200 μL无菌 PBS，试验组小鼠经皮下注射等剂量滴度为1×103TCID50/100 μL PRV溶液，观察小鼠临床症状，并分别于PRV感染后48、72、96 h处死对照组和试验组小鼠，取其脑组织，进行后续试验。

1.1.2 主要试剂 动物组织线粒体提取试剂盒( M0020)，北京索莱宝科技有限公司产品；SYBR Green 荧光PCR 染料(RR820A)、反转录试剂盒 (RR047A) ，TaKaRa公司产品；组织RNA提取试剂盒 (B518621) 、Mt扩增引物,上海生工生物工程有限公司产品；ATP酶检测试剂盒 (A061-1)，南京建成生物工程研究所产品。

1.1.3 主要仪器 流式细胞仪(ZE5)、荧光定量PCR仪(CFX96)，美国Bio-Rad公司产品；离心机(Heraeus X1R)，美国Thermo Fisher公司产品；透射电子显微镜(H-7650),日本日立公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脑组织线粒体提取 根据组织线粒体提取试剂盒操作规程，取100 mg～200 mg新鲜脑组织，洗净后，加入1.0 mL预冷的Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器，制备组织匀浆，离心去除组织沉淀后，将上清液经10 000 r/min高速离心沉淀线粒体，Store buffer重悬后备用。

1.2.2 线粒体超微结构检测 取各组小鼠新鲜的脑组织，切割成1 mm3大小， 在25 mL/L戊二醛溶液中固定2 h，洗涤后，经10 mg/mL锇酸固定，在500 mL/L～1 000 mL/L梯度丙酮溶液中脱水，加入树脂过夜浸透，切割成100 nm厚度，分别经过醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色后，在电子显微镜下观察。

1.2.3 PRV对各组小鼠脑线粒体肿胀度影响的检测 将提取的线粒体浓度调整为1×106个/mL，参考Zheng G等的方法[7]，经流式细胞术检测分析。与流式细胞术激光束方向同轴的前向角散射(Forward scatter,FSC)，表征线粒体相对大小，与激光束垂直的侧向角散射(Side scatter,SSC)，表征线粒体粒度，因此常用FSC/SSC比值判断线粒体肿胀度。

1.2.4 PRV对线粒体ATP酶活性影响的检测 参照试剂盒说明书，提取各试验组小鼠脑组织线粒体，根据ATP酶分解ATP的原理，采用比色皿法测定无机磷的含量，从而计算出线粒体中Na-K ATPase和Ca-Mg ATPase水平。

1.2.5 PRV对线粒体拷贝数影响的检测 提取各试验组小鼠脑组织总RNA，参考实验室已经建立的方法[8]，以线粒体保守基因细胞色素B (Cytb)为目的基因，以 β-actin内参基因，通过荧光定量PCR(real-time qPCR,RT-qPCR)方法扩增Cytb基因，并以 2ΔCt法(ΔCt=Ctβ-actin-CtCytb)计算mt DNA拷贝数。Cytb引物序列如下：

F5-TGTCGGACGAGGCTTATATTATGG/R5-TGTGGCTATGACTGCGAACAG-3。

1.2.6 统计分析 组间多重比较采用SPSS 21.0软件中的One-way ANOVA模块进行。所得结果与对照组相比较，以*P< 0.05，**P<0.01判断差异显著性。

2 结果

2.1 PRV对线粒体肿超微结构变化结果

与对照组比较，PRV感染后36 h个别小鼠出现被毛粗乱、瘙痒等临床症状，48 h后症状明显，60 h后个别组小鼠出现死亡。对各组小鼠脑组织进行TEM检测，结果如图1所示。与对照组相比，PRV感染后，小鼠脑组织线粒体有浓染现象，电子密度加大，部分线粒体出现肿胀变性，嵴消失，出现不同程度的空泡化，其中以感染后72 h和96 h最为明显。

A.对照组；B.48 h；C.72 h；D.96 h

2.2 PRV对线粒体肿胀度的影响结果

PRV感染小鼠后48、72、96 h，采用流式细胞术进一步检测脑组织线粒体肿胀度变化。与对照组相比较，PRV感染后，随着感染时间的延长，脑组织线粒体FSC/SSC逐渐增大(P<0.01，图2)。表明PRV可以增加线粒体肿胀度。

图2 PRV感染后对线粒体肿胀度的影响

2.3 PRV对线粒体ATP酶的影响结果

检测结果如图3所示，相比于对照组，PRV感染后48 h，脑组织Ca-Mg ATP酶和Na-K ATP酶出现了极显著下降(P<0.01)，且具有一定的时间依赖性(48 h～96 h)。结果说明，PRV感染后脑组织线粒体ATP酶活性降低。

1.Ca-Mg ATPase活性；B.Na-K ATPase活性

2.4 PRV对mtDNA拷贝数的影响结果

通过流式细胞术检测各组小鼠线粒体细胞色素Cytb基因转录水平的变化，并计算线粒体拷贝数。与对照组比较，随着PRV感染时间的延长，线粒体拷贝数显著降低(P<0.01，图4)。结果表明，PRV感染后可降低脑组织mtDNA拷贝数。

图4 PRV感染对mtDNA拷贝数的影响

3 讨论

脑是机体内完全分化的器官，线粒体含量丰富，具有耗氧量大、能量代谢旺盛的特点。神经递质释放和突触可塑性均依赖于线粒体代谢。线粒体障碍可造成神经元受损，从而影响大脑所支配的机体行为[9]。因此，线粒体功能障碍在脑部疾病的发病机制中起着关键作用[10]。线粒体功能障碍的前提和基础是线粒体结构的改变。PRV在感染组织周围部位神经元内进行复制，经外周神经系统移行到中枢神经系统，引起中枢神经系统出现免疫反应，并造成病理损伤[11]。本研究通过流式细胞术发现，随着PRV感染时间的延长，小鼠脑部线粒体肿胀度增加，表明PRV会引起脑组织线粒体结构改变。研究发现，PRV感染会引起宿主出现严重的神经病变，并表现出瘙痒等临床症状[12]，这可能与线粒体功能障碍有关。

线粒体是为细胞增殖、迁移和分化等多个生命活动提供能量ATP的主要细胞器，线粒体功能障碍会导致细胞发生凋亡[13]。细胞内ATP 酶(包括Na-K ATP酶和Ca-Mg ATP酶)活性是线粒体功能的重要指标。ATP是一种重要的细胞外配体，在细胞自分泌、细胞间通讯和神经递质传递等生理和病理过程中发挥着重要作用[14]。本试验发现，PRV感染后线粒体Ca-Mg ATP酶和Na-K ATP酶活性均出现显著降低。Puma D等[15]发现，PRV同属病毒单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1,HSV-1)通过与星形胶质细胞的HSPGsof位点结合诱导细胞内Ca2+增加，促进ATP释放，为病毒感染提供能量，有助于HSV-1感染神经元细胞。Murata T等[16]发现，HSV-1感染后细胞内ATP水平可维持至少6 h，在感染后期开始下降。PRV降低ATP酶的作用位点，还有待于进一步证实。

mtDNA拷贝数与线粒体基因的转录成正比，其数量保持相对恒定以维持能量供应平衡，mtDNA拷贝数在一定程度上反映了细胞内线粒体的数量，是线粒体功能障碍的标志物之一[17]。mtDNA具有不完全修复能力，主要编码氧化磷酸化相关基因，因此更容易受到氧化损伤因子的影响[18]。本试验发现，PRV感染后mtDNA拷贝数出现明显降低，进一步证实PRV可造成线粒体结构和功能改变。本试验在PRV感染的不同时间段检测脑组织线粒体的结构和功能的改变，表明PRV-HLJ株感染后，可诱导小鼠线粒体出现肿胀并降低ATP酶活性，导致mtDNA拷贝数降低。本试验为线粒体在PRV致病机理中的作用奠定了基础。然而，造成脑部线粒体结构和功能改变的具体机制还有待于进一步研究。