华荣恺 张志坚 华清泉

武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科（武汉 430060）

感音神经性聋(Sensorineural hearing loss,SNHL)是指因耳蜗（毛细胞、螺旋神经节神经元、血管纹等）、听神经、听觉中枢的器质性病变或者代谢障碍引起的听力障碍或听力损失。常见的SNHL有：药物性聋（氨基糖苷类药物、噻嗪类利尿剂、抗肿瘤药物等）、遗传性聋、突发性聋等。目前针对SNHL最主要的治疗方法是佩戴助听器和人工耳蜗植入（Cochlear implant，CI），一定程度上可以改善部分患者的生活质量[1]。但是这两者的疗效与内耳细胞的数量、功能息息相关，如果内耳细胞（尤其是毛细胞和螺旋神经节神经元）数量、功能极度低下的话，助听器和人工耳蜗的作用会非常受限。经过探索，人们发现，哺乳类动物的内耳细胞几乎是不可再生的[2]，如果损失了，就是永久性的。因此，我们需要一种方法来恢复受损的内耳细胞的数量和功能，更有效的改善听力受损的状况[3]。

干细胞是指来自胚胎或成体内、在一定条件下可以无限自我更新与增殖分化的一种细胞[4]，具有强大的再生、分化功能，人们希望用它来修复人体组织。越来越多的实验证明，干细胞内耳移植是有前景的。近些年，诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)已然成为研究的热点，本文将对iPS细胞及其内耳移植的相关进展进行综述，以求为后续的实验研究提供思路。

1 诱导性多能干细胞

iPS细胞是成体细胞在转录因子作用下，重组产生的与胚胎干细胞有类似特点的一类干细胞。2006年，Yamanaka等[5]把 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞增殖能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。iPS细胞有着其独特的优势和特点，如：容易获取、可以大量克隆，因此越来越受到研究者们的关注。到目前为止，iPS细胞在很多领域已有较深入的研究，例如：心血管内皮再生[6]、神经再生[7]、血小板再生[8]等，并且取得了显著的成果。总之，iPS细胞会是将来干细胞应用领域最有希望的细胞之一。

2 移植途径

内耳的结构非常精密且复杂，选择什么样的移植途径尤为重要。一条合适的途径不仅能保证细胞的高存活率、保持增殖分化能力，而且不影响机体正常的解剖结构与功能。目前用于iPS细胞内耳移植的途径主要有：圆窗、耳蜗底转以及子宫内注射。

2.1 圆窗

圆窗途径是目前比较成熟的一种移植途径，能既可靠又快速地将细胞注入耳蜗[9]。目前用于实验的动物主要有豚鼠、小鼠和大鼠，通常于其耳后做一纵行切口，逐层分离，寻找面神经，并于面神经后方充分暴露听泡，开放听泡即可见圆窗龛及镫骨动脉，用微量注射器将细胞悬液缓慢通过圆窗注入即可[10]。

陈等[11]将2周龄ICR小鼠进行感音神经性聋造模，4周后将iPS细胞经圆窗移植到Rosenthal’s管中，进行ABR测试发现，iPS细胞移植组的小鼠的阈值在术后8周开始呈稍降低趋势，术后12、16周，iPS细胞移植组的阈值与新霉素致聋组的阈值比较差异有统计学意义，但与正常之间也有明显差异。说明iPS细胞可以在体内存活长达16周，并可改善听力。Chen等[12]将Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc导入从正常人尿液中收集到的上皮细胞中得到胚胎干细胞样细胞团，即iPS细胞，然后将得到的iPS细胞向内耳上皮祖细胞(otic epithelial progenitors,OEPs)做进一步的诱导，并将iPS细胞与诱导得到的OEPs分别移植到NOD/SCID小鼠体内，他们发现，iPS细胞会形成畸胎瘤，但OEPs细胞不会生成畸胎瘤，说明经过进一步的诱导，干细胞的安全性得到了很大的提高。随后他们将得到的OEPs经圆窗移植到Slc26a4基因缺陷小鼠体内4周后发现，移植细胞具有迁移和分化为毛细胞的能力，以及位于Corti器的移植细胞可以与天然SGNs形成突触连接。Zhu等[13]将iPS细胞移植到6-8周龄经感音神经性聋造模ICR小鼠体内后4周发现，用CM-Di1标记的iPS细胞在鼓阶、中阶、前庭阶以及蜗轴都可见，并同时表达神经元标志物巢蛋白，这说明iPS细胞移植入内耳后，增殖分化能力依旧良好。但是仍有2只小鼠（占实验组10%）的耳蜗内发现了畸胎瘤，这会影响听力的改善，甚至会影响其他的正常结构。尽管iPS细胞在移植后可以在宿主内耳中较好的生存，但是其成瘤性是移植后非常常见的问题，而将iPS细胞做进一步诱导后便能降低畸胎瘤的发生率，故将iPS细胞的诱导细胞经圆窗途径移植入耳蜗是不错的选择。

2.2 耳蜗底转

耳蜗底转入路与圆窗入路在动物选择方面具有一致性，但在手术过程中存在一些差异，在暴露并打开听泡之后，于圆窗龛的前上方偏腹侧，以尖端直径约0.1mm的电钻在耳蜗底转钻开耳蜗骨壁，随即可见清亮外淋巴液流出，此时注入细胞即可[14]。

Ishikawa等[15]对人iPS细胞进行神经诱导得到衍生细胞，并将其移植到4周龄豚鼠的耳蜗，移植后1周，所有7只动物均发现移植细胞存活，但移植后2周，7只动物中仅有3只存活。1周和2周存活组中βIII微管蛋白阳性移植细胞的比例分别为64.3±25.4%和90.7±5.4%，VGLUT1阳性细胞在βIII微管蛋白阳性移植细胞中的比例分别为90.7±5.4%和94.3±7.0%。这些结果表明，将iPS细胞经耳蜗底转移植入耳蜗的方案是可行的。Lopez-Juarez等[16]将人iPS细胞向内耳祖细胞方向诱导后移植到成年豚鼠耳蜗，4天后在耳蜗发现较明显的炎症反应，但移植细胞仍可以迁移到整个耳蜗并存活4周。但Mustafa等[17]并未将小鼠iPS细胞进行诱导，而是直接植入4月龄成年Wistar大鼠耳蜗，发现细胞移植组与耳聋组的ABR阈值并无明显差异，并且通过耳蜗切片观察并未发现有移植的iPS细胞存活，即这种方案是失败的。

与圆窗入路不同的是，未经进一步诱导的iPS细胞经耳蜗底转植入内耳后并不能很好的存活，只有向神经向或者内耳祖细胞诱导后才能表现出一定的活力。

同时，动物模型的种类也影响iPS细胞移植的结果。无论是iPS细胞还是iPS细胞的诱导细胞，移植到豚鼠体内的效果都是很不错的。然而直接将iPS细胞移植到成年大鼠体内的效果并不理想，也许选用更小年龄的大鼠或者使用iPS细胞的诱导细胞可以取得不错的结果。但仅从目前来看，豚鼠是最适合用于iPS细胞内耳移植相关实验研究的动物。

2.3 子宫内注射

这种方法主要用于研究遗传性聋的治疗方案。Takeda等[18]发现，经子宫将野生型CX30基因转移到CX30缺失小鼠的耳囊中可以恢复听力。随后，该团队将人iPS细胞来源的祖细胞移植到CX30缺失小鼠的内耳当中，他们发现移植的细胞可以存活长达1周，并且可以在内耳非感觉区表达CX30蛋白[18]。这是首次证明外源性细胞在小鼠胚胎发育过程中成功植入的报道。但在之前，他们团队将未经诱导的iPS细胞直接移植到CX30缺失小鼠体内时，取得的结果并不理想，甚至还发现畸胎瘤的存在[19]。这说明，将iPS细胞向内耳方向做进一步诱导后，更有利于其在内耳中的生存与分化，这也为未来在胚胎发育阶段治疗遗传性聋提供依据。

除上述途径，还有一些途径在其他类型干细胞进行内耳移植时被使用，如：半规管途径[20]、耳蜗外侧壁[21]、静脉注射[22,23]、前庭入路[24]、蛛网膜下腔穿刺[25]以及中阶注射[26]，这些途径也可以尝试用于iPS细胞内耳移植。从目前来看，圆窗入路是最适合iPS细胞进行内耳移植的方案。

3 基因编辑

基因编辑是一种新兴的、能比较精准的对生物体特定基因进行修饰的一种基因工程技术，基因编辑常用的核酸内切酶包括：巨型核酸酶(Meganucleases,MNs)、锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZNFs)、转录激活因子样效应核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9，现在已经达到了可以临床应用的水平[27]。其中，CRISPR/Cas9是近些年的大热门，它将目标基因组编辑变得更方便、更有效[28]。

Hockemeyer等[29]通过回顾iPS细胞的产生和CRISPR/Cas9技术的发展时认为，现有的基础对未来遗传基因治疗是至关重要的。事实上，iPS细胞及其衍生细胞已越来越多地用于研究遗传性疾病的分子和细胞病理生理机制。然而，基于iPS细胞的研究的一个主要障碍就是致病突变的影响和遗传背景。如果能控制或者选择我们想要的基因或者基因型，那么研究会更深入，更具针对性。而CRISPR/Cas9正是使用使用一种非序列特异性蛋白质结合一个小的引导RNA分子，高效准确地完成基因修饰，产生同基因对照或同基因突变的细胞系，以便集中于由特定基因改变所引起的机制[30]。目前，iPS细胞与CRISPR/Cas9相结合的技术在很多领域已投入研究，包括免疫、代谢、血液、神经退行性和心脏疾病等的遗传性疾病，取得的成绩也是显著的，更有学者创新性的将该技术应用于HIV和新冠病毒的防治当中[31]。

目前也有关于iPS细胞与CRISPR/Cas9相结合的技术治疗耳聋方面的报道。对从MYO7A基因突变耳聋患者身上得到的iPS细胞进行基因编辑，恢复了MYO7A基因后发现，这些新细胞可以有毛细胞样的形态，患者的听觉功能也得以恢复[32]。这无疑也是基于iPS细胞治疗遗传病的又一手段，而且这种方案是可行的。

4 问题与展望

有学者认为，iPS细胞可视作干细胞疗法最万能的来源[33]，容易获取，有极强的增殖分化能力。它在内耳移植领域的前景也十分广阔，但也有一些问题亟待解决。成瘤性便是其中之一[4]。目前很多实验报道中均提及畸胎瘤的产生[12,19]，可能与iPS细胞自身增殖能力有关，但经过再次诱导的iPS细胞往往不会产生畸胎瘤[12]，这也说明了对iPS细胞进行再次诱导对移植效果的重要性。

免疫排斥是另一个不可忽视的问题。单纯将干细胞移植进内耳，难免会产生炎症反应，这样不利于细胞的存活与分化，很难取得理想的结果。有学者在完成细胞移植之后，给动物注射环孢素，发现可以提升移植细胞的存活率和分化效果，这样是可行的[17]。不过近些年，间充质干细胞的免疫调节能力备受关注，有报道指出[34]，同源性间充质干细胞可以减少iPS细胞衍生的同种异体心肌细胞移植后的免疫排斥反应，Ishikawa等[15]在完成细胞移植后给豚鼠静脉注射骨髓间充质干细胞，发现移植细胞的存活率大大提高，这表明将iPS细胞或者其衍生细胞与间充质干细胞进行共移植，是降低免疫排斥反应的不错选择。

如果能克服上述问题与困难，选择目前最佳的圆窗途径，并适度配合基因编辑技术，iPS细胞在治疗感音神经性聋方面定会取得重大突破，为患者带来福音。