陈 昊，范文娟

(江汉大学附属医院武汉市第六医院口腔科，湖北 武汉 430015)

口腔医学中种植修复手术常因骨量不足导致治疗效果不理想，寻找影响人成骨细胞分化的可靠手段有重要临床意义。成骨细胞的骨结合效应是种植体成功的关键，成骨细胞在种植体表面的黏附、增殖、分化等过程对形成理想的骨结合界面有重要意义。Choukroun′s富血小板纤维蛋白(Choukroun′s platelet-rich fibrin，PRF)取材简单、制备过程简易、无异体成分，在牙槽嵴保存[1]、牙移植[2]等方面已有报道，已成为骨组织工程材料研究的热点。目前PRF的临床应用仍受到限制，应用不广泛，探讨人源PRF对成骨过程的作用效果及具体调控机制对PRF的临床推广有重要意义。Kyyak等[3]研究显示，PRF与人成骨细胞共培养，细胞增殖活力和代谢活力得到显著提升。报道显示，相较于富含血小板的血浆制品，PRF可释放更丰富的细胞因子，在促进血管生成、激活免疫系统方面更有优势，有助于促进骨结合与重建[4]。研究表明[5]，细胞外调节蛋白激酶1/2-Runt相关转录因子2(ERK1/2-Runx2)通路是成骨细胞分化的网络中心，该通路能够正性调节间充质干细胞的成骨分化过程，但该通路在PRF促进人成骨细胞增殖分化中机制尚不确定。目前研究多选择动物源成骨细胞开展PRF的研究，且多集中于细胞增殖方面[6]，而关于不同浓度PRF浸出液对人源成骨细胞的作用机制较少报道。本研究通过制备含多种细胞因子的人源PRF浸出液，应用人牙槽骨制备人成骨细胞，观察不同浓度PRF浸出液对人成骨细胞分化过程中ERK1/2-Runx2通路的影响，为PRF的临床推广提供更充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料牙槽骨取自本院口腔科2021年1～6月收治的拔牙后行牙槽骨修整术患者5例，年龄18～35岁，排除牙周病、全身性系统疾病、骨代谢疾病、骨折、酗酒或药物滥用等患者；血样取自体检中心的健康志愿者5例，均经受试者签字同意后取材。含10%FBSDMEM完全培养基(武汉尚恩生物技术有限公司)，碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)，I型胶原蛋白免疫组化染色试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，BCA蛋白定量分析试剂盒(武汉博尔夫生物科技有限公司)，茜素红(美国Sigma)，兔抗人ERK1/2、磷酸化ERK1/2、Runx2(美国Abcam公司)，HRP标记的山羊抗兔IgG单抗(上海远慕生物科技有限公司)。倒置相差显微镜(日本奥林巴斯，CKX53型)，酶标仪(美国Bio-rad，iBIO-RADMark)。本研究获得我院伦理委员会审批。

1.2 人成骨细胞制备无菌条件取临床拔牙后行牙槽骨整修术患者的牙槽骨，采用组织块法[7]原代培养：于DMEM培养基修整边长1 mm的立方体组织块，磷酸盐缓冲液充分洗涤后，按照体积比1∶2加入红细胞裂解液，室温培养10 min后离心，取骨组织，接种至细胞培养瓶，血清湿润后翻转，加入完全培养基培养4 h后翻转，继续同条件培养(37 ℃、5%CO2、95%湿度)，换液频率1～2次/周，80%细胞融合后传代培养，取第二代细胞进行碱性磷酸酶染色法鉴定，显微镜下见细胞内较多蓝紫色颗粒即为人成骨细胞，用于后续实验研究。

1.3 PRF及其浸出液的制备采集健康受试者空腹静脉血10 ml，3000 r/min离心后，弃去上层血细胞血浆层，用无菌镊取中间层(PRF凝胶)，剪去下层红细胞层，PRF凝胶置于无菌纱布轻压为膜状[8]，-80 ℃保存备用。修整PRF为7 mm×7 mm小膜片，置于24孔板取两个孔，分别置入1片和2片PRF膜，均加不含FBS的DMEM培养液2.5 ml，培养箱孵育24 h后，1400 r/min离心5 min，上清液滤器(0.22 μm)过滤，获得1×PRF浸出液(1×PRFe)和2×PRFe，4 ℃分别保存备用[9]。

1.4 分组及干预方法96孔板接种细胞密度8×103/ml的第二代人成骨细胞，分为对照组、PRF1组和PRF2组(5个复孔)。PRF1组用含1×PRFe的DMEM完全培养基(1∶1)培养，PRF2组用含2×PRFe的DMEM完全培养基(1∶1)培养，对照组用DMEM完全培养基培养。

1.5 观察指标

1.5.1细胞增殖活力检测 取第二代人成骨细胞，按照上述“1.4”中的分组和干预方法，每隔2 d换液，培养至1、3、7 d，加入现配MTT20 μl/孔，继续培养4 h后弃去上层液，加入DMSO150 μl/孔，充分混匀使溶液澄清，酶标仪测定吸光度(A)570 nm。

1.5.2碱性磷酸酶(ALP)活性检测 取培养至1、3、7 d时的各组细胞，倾去培养液，每孔用PBS轻柔冲洗2次，加入0.1%的Triton X-100 0.5 ml/孔，4 ℃静置8～10 h，震荡后按照ALP检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)说明书操作，酶标仪测定A510 nm。

1.5.3I型胶原检测 取培养至7 d时的各组细胞，倾去培养基，PBS×2次，加4%多聚甲醛固定20 min，蒸馏水×3次，按照试剂盒说明书步骤染色，Image-Pro-Plus 6.0软件分析I型胶原平均灰度值，代表其表达水平。

1.5.4茜素红矿化结节检测 取培养至14、21 d时的各组细胞，倾去培养基，PBS冲洗2次，用4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素红染色25 min(37 ℃)，ddH2O冲洗，显微镜下观察，并用Image-Pro-Plus 6.0软件分析红色钙结节情况，以积分光密度表示。

1.5.5Western blot法检测蛋白表达 取培养至7 d时的各组细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，细胞裂解液裂解25 min、沸水浴8 min，12000 r/min离心15 min，取上清测总蛋白含量，进行SDS-PAGE电泳，经转膜、封闭、洗膜，加入稀释一抗(1∶300 p-ERK1/2、1∶500 ERK1/2、1∶200 Runx2)，4 ℃过夜，加入稀释二抗(1:2000)，室温2 h，电化学发光显色，软件分析蛋白条带灰度值，与内参β-actin的比值即为p-ERK1/2、ERK1/2、Runx2的相对表达水平。

1.6 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差描述，两组间比较采用LSD-t检验；多组间比较采用重复测量数据的方差分析。校验水准α=0.05。

2 结果

2.1 人成骨细胞鉴定组织块消化培养48 h后可见细胞从骨组织边缘爬出，多角形为主，72 h后细胞数量明显增多，以骨组织为中心呈小梁网络状向周围生长，7 d开始逐渐汇集成单层细胞，见图1a；经碱性磷酸酶染色，人成骨细胞内呈现较多蓝色颗粒，见图1b，1c。

2.2 各组成骨细胞增殖活力比较与对照组比较，PRF1组和PRF2组MTT实验A值均升高，且PRF2组高于PRF1组(P<0.05)；与培养1天比较，培养3、7天时三组MTT实验A值均升高，且培养7天高于培养3天(P<0.05)。见表1。

2.3 各组成骨细胞ALP活性比较与对照组比较，PRF1组和PRF2组ALP活性升高，且PRF2组高于PRF1组(P<0.05)；随时间的延长，对照组、PRF1组和PRF2组ALP活性均升高(P<0.05)。见表2。

图1 人成骨细胞分离及鉴定a：培养7 d后倒置相差显微镜观察(×100)；b：培养14 d TNAP活性(ALP染色，×40)c：培养14 d TNAP活性(ALP染色，×400)

表1 各组成骨细胞增殖活力比较

表2 各组成骨细胞ALP活性比较

2.4 各组成骨细胞I型胶原免疫组化比较培养7天，对照组、PRF1组和PRF2组I型胶原平均灰度值分别为(30.26±4.51)、(58.30±4.87)、(71.44±6.05)，组间比较差异有统计学意义(F=82.281，P<0.001)。PRF1组和PRF2组I型胶原平均灰度值高于对照组(t=9.446；t=12.203，均P<0.001)，PRF2组高于PRF1组(t=3.783，P=0.005)。见图2。

图2 三组成骨细胞I型胶原免疫组化染色 a:对照组; b:PRF1组； c:PRF2组(×200)

2.5 各组成骨细胞茜素红染色钙结节积分光密度比较培养14、21天，与对照组比较，PRF1组和PRF2组钙结节积分光密度较高，且PRF2组高于PRF1组(P<0.05)；培养21天三组钙结节积分光密度均高于14天(P<0.05)。见图3、表3。

2.6 各组成骨细胞ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达比较各组ERK1/2相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；PRF1组和PRF2组p-ERK1/2、Runx2蛋白相对表达量高于对照组，且PRF2组高于PRF1组(P<0.05)。见图4、表4。

图4 免疫印迹法检测成骨细胞ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达

表4 各组成骨细胞ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达比较

3 讨论

口腔种植修复在临床上已广泛应用，但牙槽嵴或牙槽骨壁缺损、上颌窦位置低等骨量不足问题增加了种植修复困难程度，限制了种植修复的适应症。骨移植、生物膜覆盖引导骨再生是临床常用解决骨量不足的方法，但前者存在二次手术、免疫排斥等问题，后者存在创口闭合困难、继发感染的问题[10，11]。骨痂形成、骨改建等过程中成骨细胞分化起重要作用，同时多种细胞因子、纤维蛋白等参与调控成骨细胞增殖分化过程，因此利用自体血液成分制品成为种植修复的新思路[12]。PRF含血管内皮生长因子、血小板衍生因子等细胞因子，参与成骨相关细胞分化过程[13]。本研究设置不同浓度PRF浸出液，通过检测PRF对人成骨细胞增殖分化过程中ERK1/2-Runx2通路蛋白表达的变化，以探究PRF在此过程中的作用机制。

本研究发现，与对照组比较，PRF1组和PRF2组MTT实验A值及ALP活性均升高，且PRF2组高于PRF1组，随时间的延长，3组MTT实验A值及ALP活性呈升高趋势，提示PRF浸出液可显著促进人成骨细胞增殖，且2个PRF膜制备的浸出液促进效果更好。研究显示，应用注射型PRF可促进兔成骨细胞增殖，且呈时间依赖性[14]，与本研究结果相符。2个PRF膜制备的浸出液效果更好，可能为双层膜在37 ℃孵育后可获得更丰富的细胞生长因子，从而发挥促进细胞增殖的作用。本研究PRF1组和PRF2组I型胶原平均灰度值及钙结节积分光密度均高于对照组，且PRF2组高于PRF1组，提示PRF浸出液可显著促进人成骨细胞的成骨能力，且2个PRF膜制备的浸出液效果更佳。成骨细胞可合成和分泌有机骨基质，其主要成分为I型胶原，在参与调控骨矿化和维持骨架完整方面起关键作用，同时在细胞外微环境中可传递细胞信号[15]。ALP是早期成骨分化特异性酶，可水解有机磷转化为无机磷，参与骨细胞矿化过程。Shah等[16]在仿生种植体表面涂布含有可注射PRF的成骨样细胞系MG-63，结果显示，相较于未涂布组，涂布组具有更强的增殖矿化能力，由此推测PFR更有利于成骨细胞增殖分化，利于形成种植体骨结合界面。

ERK1/2与多种细胞增殖、凋亡等过程关系密切，ERK1/2被上游信号磷酸化激活后，可调控下游转录因子，从而发挥关键调控作用[17]。目前认为，Runx2是成骨特异性转录因子，是联系细胞内外成骨相关信息的中心枢纽[18]。ERK1/2可直接影响下游Runx2的转录活性。Yuh等[19]研究显示，外源性局部给予ERK1/2-Runx2信号通路上游基因发育内皮基因座1(DEL-1)，可逆转DEL-1缺陷小鼠骨再生缺陷，活化ERK1/2-Runx2信号通路，促进成骨细胞分化。Park等[20]在体外研究中发现，紫玉苷I可通过激活ERK1/2-Runx2促进成骨细胞增殖和分化。ERK1/2-Runx2在成骨细胞增殖和分化中起重要调控中，本研究结果显示1个或2个PRF的浸出液干预后，p-ERK1/2、Runx2表达上调，且2个PRF的浸出液更高，提示PRF可能通过促进ERK1/2磷酸化，上调Runx2表达，激活ERK1/2-Runx2信号通路参与人成骨细胞增殖分化。

综上，Choukroun′s富血小板纤维蛋白可能通过激活ERK1/2-Runx2信号通路参与人成骨细胞增殖分化过程，为Choukroun′s富血小板纤维蛋白的临床应用提供更多理论依据。